全球首例神經疾病模型豬在中國誕生，可模擬亨廷頓舞蹈症

在廣州九龍鎮有一座 "豬賓館"，生活著一群不尋常的實驗小豬，它們能模擬人類的疾病，這裡的科學家利用基因"剪刀" （CRISPR-Cas9）， 精準地把人突變的亨廷頓基因"粘貼（敲入）"到小豬的亨廷頓基因中，從而使豬患上了亨廷頓舞蹈症，全球首例神經疾病模型豬就此誕生！

撰文 | 孫小橘 木三子（中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院 暨南大學）

來源 | 科學大院（ID:kexuedayuan）

我國科學家領銜的國際研究團隊經過4年努力，利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9）和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈症基因敲入豬，能精準地模擬人類神經退行性疾病。

該項成果於北京時間3月30日在線發表在生物學頂尖學術期刊《Cell》上，該研究為開發治療亨廷頓舞蹈症的新手段提供了穩定、可靠的動物模型，也為培育其它神經退行性疾病大動物模型提供了技術範本和理論依據。

中科院院士裴鋼教授在得知該成果發表後指出，在國家的前瞻性布局下，我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學家在豬的疾病模型研究中又取得重大進展，表明我國在大動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫藥產業的創新發展。

論文共同通訊作者為暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員、美國Emory大學李世華（Shihua Li）教授。

圖1：研究團隊 李曉江教授（前排中），賴良學教授（前排右一），李世華（Shihua Li）教授（前排左一）

什麼是亨廷頓舞蹈症

亨廷頓舞蹈症與阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化症等其他神經退行性疾病一起，嚴重威脅著人類健康。這些疾病伴隨年齡漸長而產生、可遺傳、呈漸進性發展，由於缺乏合適的動物模型進行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。

圖2：與衰老相關的神經退行性疾病

亨廷頓舞蹈症是由單基因（HTT）突變導致的神經退行性疾病。神經退行性疾病的致病蛋白變異後沉澱在神經細胞中，造成神經細胞功能紊亂，並引發神經細胞死亡，從而導致疾病發生。亨廷頓舞蹈症是一個理想的疾病模式，可用於研究蛋白質錯誤摺疊如何引起選擇性的神經退性病變，是以後研究多基因突變病症的基礎。

圖3：亨廷頓舞蹈症致病機理（來源：網路）

選擇豬作為研究模型，為什麼？

為了研究神經退行性疾病的致病原因和治療手段，動物疾病模型必不可少，然而目前，常見的一些動物模型都存在局限性：

小鼠：作為最常見的動物模型，小鼠已被廣泛地用於研究人類疾病機理和尋找臨床治療方法。李曉江團隊在研究中發現，神經退行性疾病小鼠模型，並不能表現出像病人腦中一樣的典型神經細胞死亡的重要病理特徵。而且，許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。

猴子：早在2008年，李曉江、李世華（Shihua Li）就在美國Emory大學合作者的支持下，將外源性的突變基因引入到獼猴的體內，建立了世界首隻轉基因亨廷頓病猴模型。不過李曉江教授說，在猴模型中，雖然可以明顯地觀察到相應的病理特徵和行為變化，但表達外源性致病基因片段的毒性過強，轉基因猴基本在出生後較短時間內就死亡，無法繁殖，不能達到篩選治療疾病的藥物的目的。另外，成熟的克隆猴技術最近才剛剛突破，還有待進一步的技術優化。

與果蠅、線蟲、小鼠等小型動物相比，豬被公認為是人類醫學研究理想的大動物模型。賴良學教授解釋說，豬的心血管系統、消化系統、皮膚、營養需要、骨骼發育以及礦物質代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習性允許進行反覆採樣和進行各種外科手術。而且與非人靈長類動物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產仔多，便於根據特殊需要進行選育。

圖4：模擬人類疾病的轉基因豬

所以，豬的疾病模型更合適藥物篩選、人類疾病研究、評估幹細胞治療的研究結果，更容易轉化為臨床應用。作為華南地區重要的大動物疾病模型實驗平台之一，賴良學團隊先後建立了50餘種在生物醫藥和農業領域具有重要價值的轉基因和基因打靶克隆豬。

"基因魔剪"和克隆技術 催生疾病模型豬

2010年，李曉江、李世華（Shihua Li）找到了賴良學教授，建立了轉基因亨廷頓舞蹈症豬模型。

不過，與猴模型一樣，轉基因豬模型也具有明顯的表型特徵，但不易存活、無法傳代。這一問題讓他們感到非常困惑，"人是在某個定點基因突變而導致亨廷頓疾病，而目前轉基因技術是隨機性的在內性基因中插入外源性突變基因，其表達量也高於內源性致病基因。"

擺在科學家面前的是一個難題：大動物轉基因模型能夠模擬神經細胞的凋亡和死亡，但由於表達外源性致病基因片段的毒性過強，轉基因動物壽命較短，不能成功地將遺傳基因進行傳代。

團隊分析，亨廷頓舞蹈症是內源性基因突變而造成的，如果直接把豬的內源性基因定點替換為人類亨廷頓疾病的突變基因，豬的病理變化應該與病人的病理狀態更接近。然而，大動物沒有成熟的幹細胞培養體系，應用傳統方法基因敲入的效率太低，在大動物中很難獲得理想結果。

圖5：利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9）等技術

培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬

2013年，基因編輯技術（CRISPR/Cas9）被廣泛應用於哺乳動物中。在廣東省科技計劃的支持下，研究團隊通力合作，利用基因編輯技術將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內源性亨廷頓基因的表達框中（即人外顯子1中包含的150 CAG重複序列精確地插入豬的HTT內源性基因中）。

圖6：將人的HTT突變基因插入豬的HTT基因中

接下來，就是利用成纖維細胞篩選出陽性克隆細胞，這並非一件易事，需要把"單細胞逐個挑出來並進行篩選及鑒定，一定要挑選狀態最好的細胞用來胚胎移植"。

負責此項實驗工作的閆森先後篩選了上千個細胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態最好的細胞。閆森說，"每天早上7點進入細胞間，看細胞、換液、不停地跟細胞打交道，一抬頭已是下午3點。好不容易篩選到的陽性克隆細胞如果狀態不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優的細胞克隆。"

圖7：篩選陽性克隆細胞

篩選到理想的細胞後，他們運用體細胞核移植技術進行克隆，成功培育出帶有突變基因的新生豬。在出生5個月後，科學家觀察到這種亨廷頓豬出現了運動障礙等漸進性發病的表型。

下一步實驗就是要將穩定表達致病基因的亨廷頓豬繁殖下去。由於疾病模型豬身體狀態不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特徵更接近於人類，李世華（Shihua Li）教授多次從美國返回中國指導實驗，親自去豬場觀察小豬的生存環境及生活狀態。

在團隊的呵護下，F1代小豬終於出生，實驗成功了！結果驗證，該模型豬不但能夠模擬亨廷頓病患者在大腦紋狀體的神經元選擇性死亡的典型病理特徵，在行為上也表現出類似亨廷頓病"舞蹈樣"的異常行為。關鍵在於，這些病理及行為學表型都可以穩定地遺傳給後代。

圖8：亨廷頓疾病模型豬（HD-KI）能模擬病人的病理及行為特徵

里程碑式的發現

從事多年研究亨廷頓病的權威專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東(X. William Yang)教授指出，亨廷頓舞蹈症基因敲入豬的建立是神經退行性疾病研究領域中一個里程碑式的發現，使科學家能更深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經病理變化特別是腦疾病方面，大動物模型比小動物模型更具優勢。

神經疾病基因敲入豬的成功，將推動我國發展大動物疾病模型的醫藥研發產業鏈，促進針對阿爾茨海默病、帕金森症、脊髓側索硬化等神經退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新葯研發進程。同時，該動物模型可更好地應用於幹細胞治療等手段的臨床前評價從而進行臨床轉化，最終造福於人類。

（除圖3外，圖片均由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院、暨南大學提供）

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