克隆性造血引起血漿循環遊離DNA基因檢測假陽性

血漿循環遊離DNA（cfDNA）基因組分析被越來越多地臨床應用於晚期癌症的無創基因檢測。美國FDA已經批准了Cobas EGFR Mutation Test v2、MSK-IMPACT和FoundationOneCDx等液體活檢基因檢測方法。

然而腫瘤組織和血漿循環遊離DNA之間的不一致性妨礙了這些新方法的應用和解讀。引起不一致性的原因可能有：（1）脫落到血漿中的腫瘤DNA是可變的；（2）腫瘤異質性。

由於大部分血漿循環遊離DNA提取於外周血細胞，非惡性造血細胞，比如克隆性造血的體細胞突變可能引起血漿循環遊離DNA基因檢測假陽性。

KRAS突變

美國哈佛大學丹娜法伯癌症研究院的Geoffrey R. Oxnard等使用數字PCR法（ddPCR）檢測了58例EGFR突變非小細胞肺癌患者的外周血漿，其中2例患者同時檢出KRAS突變。

第1例患者是一位78歲的女性晚期非小細胞肺癌，確診時檢出血漿中EGFR Del 19和KRAS G12D突變。患者服用特羅凱20個月取得持久的緩解，血漿中EGFR突變被清除，然而KRAS突變一直存在，見圖1。腹部B超，CT和結腸鏡並沒有發現隱匿性腫瘤。

以往文獻報道過極少數克隆性造血患者存在KRAS突變，因此重新檢測了配對外周血細胞和血漿，發現KRAS G12D突變等位基因分數在外周血細胞中為0.5%，血漿中為1.2%。對外周血細胞進一步檢測發現，KRAS突變僅存在於淋巴細胞中，使用二代測序驗證了數字PCR的結果，而且沒有發現其它腫瘤相關基因突變，證明這位患者血漿中的KRAS突變源自淋巴系祖細胞的獲得性基因突變和克隆增殖。

第二例患者是一位61歲的女性晚期非小細胞肺癌，手術切除標本檢出EGFR L858R突變和KRAS突變陰性。患者服用特羅凱耐葯後，使用二代測序檢測血漿循環遊離DNA，檢出KRAS G12S突變，然而未檢出EGFR L858R突變，數字PCR法驗證了這一結果。外周血細胞中同樣檢出G12S突變，EGFR L858R突變仍為陰性。使用二代測序檢測特羅凱耐葯後的腫瘤組織，發現EGFR L858R和T790M突變，卻未檢出KRAS突變。

TP53突變

使用二代測序檢測來自丹娜法伯癌症研究院122例晚期非小細胞肺癌患者的143份血漿樣本，檢出14個與克隆性造血相關的三種基因突變（JAK2、GNAS和IDH2），其中6份為JAK2 V617F突變，該突變在非小細胞肺癌中罕見（僅0.26%）。使用數字PCR檢測了其中5份的配對外周血細胞樣本，都檢出JAK2 V617F突變。使用二代測序檢測3份血漿樣本JAK2 V617F突變的配對腫瘤組織樣本，JAK2突變均為陰性。

TP53突變非小細胞肺癌患者中很常見，同時也存在於克隆性造血患者中。在143份血漿樣本中檢出108個TP53突變。7份血漿樣本中檢出超過2種TP53突變，而在配對的腫瘤組織樣本中僅檢出一種。33個TP53突變具有配對的腫瘤組織、血漿和外周血細胞樣本，其中14個TP53突變在腫瘤組織和血漿樣本中檢出，而在外周血細胞樣本中未檢出；另外有5個TP53突變在血漿和外周血細胞樣本中檢出，而在腫瘤組織樣本中未檢出，提示這些TP53突變源自克隆性造血的基因突變克隆；另外有14個TP53突變在血漿樣本中檢出，而在腫瘤組織和外周血細胞樣本未檢出，由於其中13個TP53突變的血漿樣本中等位基因分數≤0.5%,接近方法的檢出限，結果難以驗證。

討論

如果經合格的血漿循環遊離DNA基因檢測方法，檢出與克隆性造血無關的EGFR、BRAF和MET等肺癌驅動基因，結果是可信的，可以應用相應的靶向藥物治療。然而如果血漿樣本中檢出KRAS和TP53突變，這可能是源自克隆性造血，需要經外周血細胞和腫瘤組織樣本的基因檢測的對照驗證。

使用數字PCR和二代測序檢測血漿循環遊離DNA具有無創和高靈敏度的優點，但對檢測結果應謹慎解讀。

克隆性造血

人類擁有1萬~2萬個造血幹細胞，每天能分裂產生1000億個新的血細胞，每個細胞約10年便會產生一個突變。這些基因突變與年齡密切相關，老年女性中比例更高，40歲以下者發生率極低。儘管其中大多數突變為無功能的過客基因突變，不增加造血細胞克隆的擴張潛能。但部分突變基因為驅動基因或血液腫瘤相關基因，其突變可導致造血幹細胞獲得增殖和自我更新優勢。

5394例實體瘤患者中，25%存在克隆性造血。放化療和吸煙將增加克隆性造血的發生率。克隆性造血理論上可能導致繼發血液腫瘤的風險增高，但在這些患者中罕見。

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