PLANT PHYSIOL：iTRAQ植物高分文章解讀

發表時間：2018

發表期刊：《Plant Physiology》

影響因子：6.392

研究背景

ACTIN相關蛋白（ARP6）突變植物的根部表型變化與Pi低濃度下表型類似，主根較短，根須密而長，從而影響植物對磷酸鹽的攝取。Ovarian tumor domain（OTU）屬於去泛素化酶基因（DUBs）家族，在擬南芥中很少被研究，該家族涉及通路和基因與ARP6相似。

研究目的

為了揭示OTU5基因在植物根形態生長和Pi吸收中的功能和機制，作者通過蛋白組學和相關功能實驗研究OTU5基因突變以及在Pi應激下引起根形態變化的分子機理。

研究思路

研究結果

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在Pi不同濃度條件下根的表型研究

與野生型相比，otu 5和arp 6突變型單位長度根須數量顯著增加（36%），主根長度變短，根須顯著變長；otu 5和arp 6沒有明顯的區別；otu 5/arp 6雙突變也呈現otu 5的表型，且變化更加明顯，有性狀疊加的現象。其它幾種otu 5/OTU5和OTU 5 OE沒有變化（圖1）。總之，作者發現OTU5基因不依賴於ARP6，能夠抑制根的生長。此外，Pi低濃度下多種突變類型的根須明顯改變，除了otu 5/arp 6雙突變型植物。

圖1. Pi高濃度（上）和低濃度（下）條件中根的表型

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iTRAQ分析差異蛋白

首先，對Pi高濃度下Wt和otu5進行差異蛋白分析，總共發現10,328個蛋白，其中在otu 5中，分析發現了223個差異上調，267個為差異下調蛋白（圖2）。

actin-like ATPase家族蛋白At2g42100顯著上調4.5 fold，該蛋白與染色體重構因子ARP4, ARP5和ARP6 等相關；SNF2-RING-HELICASE-LIKE3（FRG3）, CHROMATIN REMODELLING8（CHR8）等差異蛋白也明顯上調，與蛋白和細胞的生長有密切的關係。這些結果表明otu 5突變型植物改變了染色體和根須相關的蛋白的表達。

圖2. Pi高濃度下Wt和otu 5型植物差異蛋白分析

其次，分別研究Wt和otu 5在Pi高濃度和低濃度下的差異蛋白，在Wt中發現382個差異上調和255個差異下調蛋白，這些差異蛋白多數與Pi 吸收和循環相關，如plasma membrane Pi transporters Pht1;1,Pht1;2和Pht1;4以及調節因子SPX1等；同時發現了一個新的分子XUT1（7.3-fold）與根變形生長相關。這些結果表明，低濃度的Pi處理誘導了Wt植物的根須相關蛋白的變化。

在otu 5中差異上調的蛋白（394個）與Wt類似，但是差異下調蛋白只有75個，這暗示了OTU 5基因可能作為低Pi濃度反應蛋白的一種抑制分子。

圖3. Pi高濃度（A,B,C）和低濃度（D,E,F）下差異蛋白分析

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蛋白互作網路分析

通過GeneMANIA（http://genemania.org），分析結合蛋白-蛋白互作（PPI）和基因共表達網路分析，顯示在otu 5植物中一些染色體重構相關的蛋白下調錶達，一些histonemodifications, DNA methylation, pre-mRNA splicing, chromatin assembly和transcription等DNA進程相關基因也出現下調趨勢，這些結果說明OTU 5基因的突變與染色體相關蛋白有密切的關係。

圖4. Wt和otu 5染色體相關差異蛋白，基因網路分析。

黃色節點表示上調蛋白；藍色節點表示下調蛋白；紫色節點表示Pi低濃度下差異蛋白；綠色表示與蛋白互作的基因

同時，利用Pi低濃度下和高濃度下，otu 5植物特有的差異蛋白（Wt中沒有）進行網路調控分析，發現一些組蛋白間如HTB4,HTB9等，組蛋白和相關基因間如HTB4-HTA8等的互作關係（圖5）。這表明不同的基因型在Pi不同條件下具有特有的調控機制。

圖5. otu 5植物不同濃度下特有差異蛋白網路分析。

黃色節點表示差異蛋白；藍色節點表示與蛋白互作的基因。

此外通過STRING（http://string-db.org），發現一些根須相關蛋白peroxidases如At4g26010, At1g05240, RHS19,At3g49960以及formins如FH2, FH8,RSH15, XTH14等在Pi低濃度otu 5植物中下調，暗示它們在根鬚生長中發揮一定作用。

圖6. otu5中差異下調的根須相關蛋白網路互作分析

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功能實驗

為了研究otu 5的表型變化機理，作者利用ChIP-qPCR發現根須morphogenesis相關基因（XTH26）)和chromatinremodeling (FRG4)與前人報道的組蛋白H2A.Z結合。

最後研究 reactive oxygen species（ROS）distribution變化對根須的影響，利用3』-(p-hydroxyphenyl)fluorescein HPF 檢測過氧化氫，在Wt中低濃度Pi培養下，熒光減弱；otu 5中在低濃度Pi培養下熒光減弱更明顯，約為Wt的三分之一（圖6）這些結果表明OUT5突變參與擬南芥相關生理功能。

圖7. 根組織reactiveoxygen species (ROS)的分布

小 結

本文的植物材料豐富，條件處理後表型差異明顯，採用iTRAQ技術後得到了較多差異蛋白，方法和思路比較簡潔。結合前人的研究結果以及網路調控分析，發現OUT 5突變通過影響一些根形態生長和染色體重構相關的蛋白，進而調控根不同Pi條件下的形態發育。

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參考文獻

Suen, D. F., Tsai, Y. H., Cheng, Y. T., Radjacommare, R., Ahirwar, R. N., Fu, H., & Schmidt, W. (2018). The Deubiquitinase OTU5 Regulates Root Responses to Phosphate Starvation.Plant physiology, pp-01525.

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