腫瘤科研方法學：MassARRAY質譜技術在腫瘤檢測中的應用
01
概述
MassARRAY系統最初由美國Sequenom公司開發，是世界首台獲得美國FDA批准用於臨床基因檢測的質譜技術平台，Agena Bioscience公司MassARRAY核酸質譜技術平台的臨床應用版「IMPACT Dx系統」於2014年6月16日獲得美國FDA認證，可用於臨床分子診斷應用，從而成為世界上第一台，也是唯一一台獲得FDA臨床認證的核酸質譜平台。目前已被FDA批准用於臨床檢測，這項技術結合了兩項諾貝爾獎（PCR技術和質譜技術），它巧妙的將布魯克公司的質譜儀激光管拉長，實現了更長的檢測範圍，可作為高通量測序平行試驗對比，此技術具有無以倫比的優勢。在癌症研究、遺傳學分析、分子診斷和藥學等領域已經得到越來越廣泛的應用，受到全球多個頂尖研究中心的推崇。飛行時間質譜技術搭配不同Sequenom的檢測和軟體模塊，可以實現：
SNP分型以及SNP位點等位基因頻率計算；
體細胞突變檢測和分析；
甲基化定量分析；
基因表達定量分析；
CNV檢測分析；
寡核苷酸質量控制和檢測。
02
平台技術原理
Sequenom SNP 檢測系統基本原理為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF MS) 技術。主要特點是，PCR擴增後的產物，加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點上，延伸 1個鹼基。然後將製備的樣品分析物與晶元基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管 , 而後用瞬時納秒 (10-9s) 強激光激發，由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附並轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。MALDI產生的離子常用飛行時間（Time-of-Flight,TOF）檢測器來檢測，離子質量越小，就越快到達。理論上講，只要飛行管長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的。MASSARRAY SNP檢測的質譜範圍為5000到8500道爾頓。
03
案例分析
廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)肺癌研究所醫學研究中心吳一龍教授的技術團隊曾利用MASS ARRAY技術做了相關肺癌多基因多位點的方法學科學研究，他們的目的是建立適合中國人群的多基因檢測方法。團隊選取確定了肺癌相關驅動基因或靶向耐葯基因。通過檢索Pubmed資料庫，結合國內外研究進展和中國人群肺癌基因譜特點，統計與中國人群肺癌發病機理、放化療、靶向耐葯以及轉移等相關的靶基因或其相關傳導通路基因，確定13個基因納入分析：EGFR、KRAS、ALK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、PIK3CA、BRAF、PTEN、MET、ERBB2、AKT1和STK11。根據Cosmic資料庫中突變位點在編碼序列的位置，在基因組序列中標記突變位點，將側翼約200個鹼基按Agena公司突變位點標示和固定格式編輯引物設計文檔。通過引物設計軟體運行上述含突變位點序列的文檔，調整相關參數將13個基因99個位點全部納入設計試劑盒，正、反向擴增引物各99條和延伸引物99條，共設計297條引物。擴增目的條帶，延伸引物設計位於突變位點前一個鹼基，與擴增產物互補進行單鹼基延伸反應。設定每孔最多檢測十個突變位點，軟體根據引物設計原則（避免形成二聚體/錯配等）隨機將99個位點的檢測分布在12孔（專利申請號：201510311868.8）。多重引物的合成與配置：上海生工生物工程有限公司合成引物。
引物配置如下：
擴增引物先稀釋成10 μM，然後工作液以每條引物濃度為0.5 μM進行混合，共12管（每管包括正、反向引物）。引物名稱末尾為P1-F和P1-R分為第1組，引物名稱末尾為P2-F和P2-R分為第2組，類推，分為12組（P1～P12）；
延伸引物先稀釋成500 μM，然後在Agena公司延伸引物配置表格中輸入每一條延伸引物的分子量，再根據表格計算的體積混合引物，共12管。引物名稱末尾為E1為第1組，引物名稱末尾為E2為第2組，類推，分為12組（E1～E12）。12管擴增引物分別對應12管延伸引物，P1對應E1，以此類推。
主要檢測結果：
在肺癌患者組織樣本中MASS檢測突變位點結果與Lung Carta法比較檢測結果結果完全一致。
與直接測序法比較靈敏度與特異度：按新建立方法檢測100例肺癌患者的腫瘤樣本，同時直接測序法檢測本研究方法包含的EGFR、KRAS基因的突變位點，本方法的靈敏度為100%，特異度為96.3%，陽性預測值為95.8%，陰性預測值為100%。
結論
在肺癌的分子分型方面，目前臨床單基因檢測方法主要有定量聚合酶鏈反應（qPCR）、直接測序、熒光原位雜交（FISH）、免疫組織化學（IHC）等。除了EGFR、ALK、KRAS等主要基因的檢測技術在臨床相對成熟之外，ROS1、RET、MET、HER2、NRTK、NRG等基因臨床檢測主要限制因素有：多個單基因分次檢測的複雜性和臨床來源標本總量不夠。臨床上肺癌早期患者接受手術（大手術或小手術活檢）具有充足的組織，晚期患者通常通過經皮肺穿刺、支氣管鏡活檢、支氣管內超聲穿刺活檢等獲得少量標本。這些標本滿足現有的臨床病理診斷和個別基因的分子檢測後，很難有剩餘材料進一步用於其他重要分子分型、藥物耐葯機制等分析。可見腫瘤樣本少、低通量、耗時性及價格昂貴等是制約臨床多次單個基因檢測開展的瓶頸。腫瘤發生髮展、靶向耐葯、複發轉移的複雜性，以及肺癌多靶點突變分別檢測的局限性，決定了在臨床轉化醫學研究中開展多基因檢測的發展趨勢。綜合以上案例和研究結論，我們可以利用不同平台進行研究和測試，以期更好地服務廣大腫瘤醫生和患者。
- 參考文獻
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蓮和醫療健康集團有限公司（股份代碼：HKEX 00928）是一家在香港上市、專註於腫瘤精準醫療領域的生物技術公司，致力於腫瘤基因檢測在臨床醫學與健康服務中的推廣和應用。為臨床醫生、癌症患者、醫院體檢、高危人群以及癌症相關領域的研究者提供科學專業的分子診療解決方案以及學術研究服務。自主研發的基因檢測產品涵蓋呼吸道腫瘤、消化道腫瘤、乳腺及婦科腫瘤、泌尿腫瘤、頭頸部腫瘤乃至泛腫瘤等，貫穿腫瘤診療中的早期篩查、輔助診斷、用藥指導、預後評估、動態監測等全病程管理環節。
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憑藉強大的研發實力和技術優勢，蓮和醫療與全國近300家三級甲等醫院及腫瘤專科醫院機構建立了精準醫療業務合作；支持、參與國內各大型醫療科研30餘項。2017年11月，蓮和醫療啟動全國首個前列腺癌BRCA1/2、ATM胚系基因突變篩查項目，受到廣泛關注。
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