安諾基因助力全球首例亨廷頓豬模型的建立，登頂Cell

近日暨南大學千人計劃特聘教授李曉江等研究團隊利用基因編輯和體細胞核轉移技術實現了全球首例亨廷頓（HD）舞蹈病豬的培育，並精準地模擬出人類HD舞蹈症的表型，研究成果發表在國際頂級學術期刊Cell上。安諾基因參與基因敲入豬的脫靶位點檢測與後續分析工作。該研究表明我國在大哺乳動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫藥產業的創新發展。

研究對象：亨廷頓舞蹈症，豬

合作單位：暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院、美國Emory大學和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院

發表期刊：Cell

發表時間：2018年3月

影響因子：30.41

研究背景

亨廷頓舞蹈病是由單基因突變導致的神經退行性疾病，是一個理想的疾病模式，是研究多基因突變病的基礎。但在以哺乳動物為模式動物模擬這種疾病研究時卻處處碰壁。例如以小鼠作為動物模型時由於體型和生理結構等與人類差異顯著所以無法模擬病人的病理特徵，許多研究結果在臨床上往往無效；以猴子為模型時由於猴子早夭等問題導致進展困難。因此，建立準確模擬疾病病理的動物模型，成為生命科學領域亟待攻克的難題。

研究思路

圖1 研究路線圖

研究結果

基因編輯將豬內源的亨廷頓基因（HTT）替換為人的HTT突變基因

從2013年基因編輯技術（CRISPR/Cas9）開始應用於哺乳動物後，李曉江教授團隊就開始利用該技術將豬內源HTT基因的第一個外顯子作為靶位點，通過構建兩條gRNA，促使豬第一個外顯子與人的HTT突變基因（包含150個CAG重複）的第一個外顯子同源重組，實現定點替換。將構建好的gRNA、供體質粒（兩側包含1Kb的豬第一外顯子兩側同源序列的人HTT突變基因）和Cas9共轉化至豬的成纖維細胞，最終實現包含150 CAG重複序列的人HTT第一外顯子精確地替換掉豬的HTT內源性基因的第一個外顯子。這樣就可以在豬的成纖維細胞中表達人突變的HTT基因。

圖2 基因編輯實現靶位點定點替換

利用成纖維細胞篩選陽性基因敲入細胞

只有陽性的基因敲入細胞進行體細胞轉移才能將人的HTT突變基因導入豬體內，因此首先需篩選陽性基因敲入細胞。為了篩選到成功的基因敲入成纖維細胞，需要對大量的轉化細胞進行篩選。PCR鑒定是最直接最快速的鑒定方法。實驗團隊從2430個成纖維細胞中篩選到9個內源HTT被替換為人HTT突變基因的陽性細胞。

圖3 陽性成纖維細胞篩選

體細胞核轉移技術培育胚胎並繁殖後代

由於細胞核具有全能性，因此可以將體細胞核轉移到去核的卵母細胞中促使其發育成新胚胎，進而獲得克隆個體。在篩選到的9個陽性成纖維細胞中選出一個狀態最好的並經過PCR證實為替換成功的成纖維細胞用於體細胞核轉移，獲得2880個胚胎。將這些胚胎移植到16個代孕豬中，10隻豬成功受孕。最終獲得7個個體，PCR鑒定後確認其中6個個體為基因敲入成功的個體。用這些基因敲入成功個體中的母豬與野生型Bama公豬交配獲得F1，然後用F1中基因敲入成功的公豬與Bama母豬交配獲得F2。通過兩年多的培育結合PCR鑒定，最終共獲得15個基因敲入成功的F1和10個基因敲入成功的F2。

圖4 體細胞核轉移培育基因敲入豬

陽性個體的脫靶位點檢測

基因編輯技術利用RNA引導Cas9核酸酶可在多種細胞的特定的基因組位點上進行切割替換，實現對特定位點的編輯，但是該系統面臨嚴重脫靶危機。以小鼠為例，基因編輯過的小鼠體內有超過1500個單核苷酸發生了突變。一旦基因敲入豬體內出現脫靶位點，那麼在後續的研究中很難辨別病理特徵是由於基因敲入引起的還是由於脫靶位點變異引起的。

為解決這一難題，實驗團隊與安諾基因攜手，由實驗室提供F1的大腦皮層，安諾基因以重測序的方式對兩個嚮導RNA脫靶位點檢測，最終結果顯示成功的敲入個體中不存在脫靶位點。所以這些基因敲入豬是可進行下一步實驗的。

圖5 脫靶位點檢測

行為和病理學研究

對這些基因敲入個體進行行為學研究發現帶有致病基因的個體在出生後前四個月並沒有表現出明顯癥狀，這些「亨廷頓豬」們與正常小豬一般可愛，但隨著年齡的增大，逐漸就顯示了與「舞蹈」症一致的特徵：皮膚鬆弛下垂、體重下降、步態異常、呼吸困難等。此外病理觀察發現，亨廷頓豬有著大腦紋狀體神經元死亡的典型病理特徵。所以亨廷頓豬模型可以精確模擬人類亨廷頓病的行為和病理學特徵。

圖6 HD基因敲入豬的癥狀

圖7 HD基因敲入豬的紋狀體特異性退行

本研究成功構建了世界首例可遺傳的亨廷頓豬模型，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經退行性疾病研究領域中一個里程碑式的發現，使科學家能更深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。文中基因編輯後對脫靶位點的檢測由安諾基因提供。

安諾優勢

動植物重測極速體驗

安諾基因推出重測序極速周期，最快僅需8個自然日就可以拿到數據。

自動化平台優勢

安諾基因擁有高通量的自動化建庫，涵蓋個體重測序、群體進化、GWAS等各個方向。

全方位脫靶位點檢測

體外全基因組檢測脫靶位點是利用Cas9和其他類似的核酸酶切割基因組時，打斷DNA雙鏈，再用高通量測序的方式進行脫靶位點檢測。這種檢測方式可以檢測到突變頻率低於0.1%的脫靶位點。安諾基因通過CRISPR-高深度全基因組測序可以對基因編輯的細胞或個體進行全方位脫靶位點檢測，可助力更快速更精準的實現和評估CRISPR基因編輯技術。

基因科技 讓生命綻放

安諾優達總部位於北京，是中國知名的基因企業、亞洲一流的基因組中心、先後獲得國家發改委首批基因檢測技術應用示範中心、國家高新技術企業、北京生物醫藥產業跨越發展工程（G20工程）企業、中國最具投資價值企業、2016中國最具科技引領力企業等資質榮譽，並擁有博士後科研工作站。

公司專註於基因組學技術在人類醫學健康和生命科學研究兩大領域的產業化應用，目前涵蓋測序儀設備、生育生殖、遺傳病、腫瘤、基因體檢、醫學研究、科研服務、基因大數據等多個業務方向。並先後與美國 Illumina公司和阿里雲達成戰略合作，是國內領先的以基因技術為核心的Bio-IT企業。

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