加入這兩個小分子，人多能幹細胞精準基因編輯效率顯著提升

責 編丨迦 漵

人多能幹細胞，包括胚胎幹細胞和誘導型多能幹細胞，可以分化出人體所有類型的細胞，比如神經細胞、心肌細胞、肝臟細胞和胰島細胞，在疾病模型、藥物篩選和再生醫學中，具有廣泛的應用前景。但是，對人多能幹細胞進行精準基因編輯卻耗時耗力，十分具有挑戰性。小分子藥物具有處理方便和非整合等優點，可用於提高基因編輯的效率和準確性【1】；然而由於在人多能幹細胞上進行精準基因編輯的效率極低，直接利用人多能幹細胞進行高通量小分子篩選非常困難。

2015年，美國Gladstone研究所和加州大學舊金山分校（UCSF）丁勝課題組與斯坦福大學Lei S. Qi課題組合作在Cell Stem Cell雜誌上發表論文稱：小分子L755507（一種有效的、選擇性的β3腎上腺素能受體部分激動劑）與Brefeldin A（一種常用的蛋白轉運抑製劑，可以特異性地可逆地阻斷蛋白質從內質網轉運到高爾基體）能夠促進基於CRISPR-Cas9的基因編輯效率【2】；不久後，NBT背靠背發表的兩篇文章報道DNA連接酶IV的抑製劑SCR7也能夠促進CRISPR-Cas9基因編輯的效率【3,4】。

CRISPR-Cpf1是最新發現的一種基因編輯工具酶，所需crRNA長度短，脫靶率低【5】，因此基於CRISPR-Cpf1系統的、在人多能幹細胞上進行的精準基因編輯具有十分廣闊的前景。不過，由於CRISPR-Cpf1和CRISPR-CAS9性質不同，因此專門針對CRISPR-Cpf1系統的、用於提高精準基因編輯效率的小分子篩選具有重要意義。

4月3日，浙江大學生命科學研究院祝賽勇實驗室在Nature Communicaitons雜誌上在線發表題為Small molecules promote CRISPR-Cpf1-mediated genome editing in human pluripotent stem cells的研究論文，篩選到了兩個小分子VE-822和AZD-7762，二者能夠顯著提高人多能幹細胞精準基因編輯效率，建立對人多能幹細胞進行更高效和精準的基因編輯技術體系，今後可以更好地應用於基礎生物學研究、疾病模型構建、藥物篩選和臨床轉化等方面，具有重要的意義。

在最新的這項研究中，研究人員對CRISPR-Cpf1在人多能幹細胞上進行基因敲除和基因敲入進行了系統性研究。為了在人多能幹細胞中建立高通量小分子篩選的系統，研究人員首先構建了一個包含U6啟動子驅動crRNA表達的盒（cassette），用於CRISPR-Cpf1介導的基因編輯。人多能幹細胞上進行的高通量篩選體系建好之後，在600餘種小分子化合物中發現了能夠顯著地提高人多能幹細胞精準基因編輯效率的小分子藥物VE-822（ATR，ataxia-telangiectasia mutated- and Rad3-related，是DNA損傷檢查點的關鍵激酶蛋白）和AZD-7762（一種有效的ATP競爭性的細胞周期檢測點激酶Chk的抑製劑）。

有意思的是，這兩個小分子藥物在點突變幹細胞株系構建和多重位點基因編輯等方面，也具有顯著的促進作用。因此，CRISPR-Cpf1基因編輯系統與小分子藥物的組合，可以實現對人多能幹細胞進行更加簡單、高效和精準的基因編輯，從而更好地應用於基礎生物學研究、疾病模型構建、藥物篩選和臨床轉化。

祝賽勇實驗室2015級博士研究生馬曉潔為論文的第一作者，祝賽勇研究員為論文的通訊作者。

參考文獻

1、Hu, J. H., Davis, K. M. & Liu, D. R. Chemical biology approaches to genomeediting: understanding, controlling, and delivering programmable nucleases.Cell Chem. Biol.23, 57–73 (2016).

2、Yu, C. et al. Small molecules enhance CRISPR genome editing in pluripotent stem cells.Cell Stem Cell16, 142–147 (2015).

3、 Chu, V. T. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.Nat. Biotechnol. 33, 543–548 (2015).

4、 Maruyama, T. et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining.Nat. Biotechnol.33, 538–542 (2015).

5、Zetsche, B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell163, 759–771 (2015).

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