Y染色體著絲粒序列解析完成的一小步，人類基因組完成圖歷史上的一大步

隨著測序技術的進步，數十年來人類基因組的研究得到了長足的發展，耗費的人力物力不斷下降，組裝的連續性和完整度不斷提升，但仍有不少區域未得到充分解析，例如著絲粒、端粒等串聯重複序列，這些區域往往被認為與細胞分裂、細胞周期、疾病等密切相關。

2018年3月，Nature Biotechnology在線發表了一篇通過對BAC文庫進行納米孔（Oxford Nanopore）長讀長測序，繪製人類Y染色體著絲粒區域線性DNA序列的方法學文章，解析了該區域長達數百kb的串聯重複，不僅有助於了解著絲粒的進化和功能，更是為通過單分子測序的方法實現人類基因組完成圖提供一種新思路。

具體實施步驟

1.建庫測序

對目標區域（人Y染色體著絲粒DYZ3區）的環形BAC(https://bacpacresources.org/)使用轉座子酶進行1次打斷，形成線性DNA後加上測序接頭，在Oxford Nanopore MiniION平台進行全長BAC DNA測序（R9.4，RAD002）。

Fig.1基於Nanopore的全長BAC DNA建庫測序示意圖

2.數據產出

每個BAC run產出數據讀長分布見Fig.2, 從10個BAC文庫（8個目標位點，2個對照）中，獲得了＞3500條全長1D reads。每個BAC產出的總數據量、全長比例和一致性序列長度見Table 1。

Fig.2 10個BAC產出數據讀長分布

3. consensus、polishing和定位、定向

通過評估對照組的數據得知原始1D數據單鹼基準確度為84.8%。經過一步consensus和polishing後得到高準確度的一致性序列（Fig.3 B、C），將全長reads比對到每個BAC的consensus reads，對照組準確度為99.2%，其它BAC為99.4–99.8%。

Fig.3數據一致性比對、polishing以及序列變異檢測策略

在前一步提高序列準確度後，使用Illumina MiSeq對BAC進行了resequencing，實施了2種變異檢測：（1）K-mer method和（2）Alignment metod （Fig.3 D），通過變異檢測結果幫助對BAC序列進行定位和排序，例如Fig.3 D右側圈圖以209 kb 長的RP11-718M18示例，使用8個BAC-polished序列，按照從p-arm到q-arm的順序拼接完整的該區段的序列。

4.組裝結果

從8個BAC的Nanopore測序數據中，組裝出了完整的人類Y染色體著絲粒區域：365Kb的α-衛星DNA序列。它包含著一段由5.8Kb的序列串聯重複而形成的長達301Kb的特殊序列（Fig.4），包含52個higher order repeats（HOR），其中有7段6.0Kb長的HOR結構變異（Fig.4 紫色）。能通過4種常見的單核苷酸多樣性而劃分形成的9種單體型（Fig.5）。至此，人類Y染色體著絲粒區域DNA序列得到完整解析。

Fig.4基於Nanopore的全長BAC DNA測序，構建人類Y染色體著絲粒DYZ3區

Fig.5CENY haplotype groupings

5.進一步研究著絲粒的進化和功能

研究人員後續對人類和其它一些類人猿種類的Y染色體著絲粒區域進行了熒光原位雜交（FISH）比對分析（Fig.6）、組蛋白表觀修飾分析（Fig.7）等，以期更深入研究著絲粒的進化和功能。

Fig.6The Y centromere location is not shared among the great apes.

Fig.7Epigenetic characterization of the Y Centromere

研究人員在這篇論文中實現了利用BAC+Nanopore測序的方法獲得完整的人類Y染色體著絲粒DNA序列（串聯重複衛星DNA），比以往的研究更完整、更精細，對序列的順序好和方向有了更準確的判斷，為進一步研究著絲粒的進化和功能以及實現人類基因組完成圖提供一種新思路，這也是Nanopore多變應用策略的一個體現。

參考文獻

[1]Jain M, Olsen H E, Turner D J, et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome[J]. Nature biotechnology, 2018.

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