放射性涎腺損傷治療的研究進展
作者：王綜述，王帥，張霓霓，黃桂林,遵義醫學院附屬口腔醫院口腔頜面外科
唾液具有消化、潤滑、保護口腔微環境的穩定以及抗菌等多種作用，對維護口腔健康至關重要。全球每年約有55萬罹患頭頸部腫瘤患者，放射治療是其治療主要的方式。口乾症是放療術後主要的併發症之一，將導致唾液分泌的減少，從而引起齲齒、黏膜炎症、真菌感染及味覺喪失等多種疾病的產生，危害患者生活質量。
傳統治療方法主要有服用促涎腺劑、腺體轉移、改進放療技術及人工唾液及細胞保護劑等，但是上述治療方法療效有限，且存在藥物副作用及有創操作等問題。因此尋找到合適的治療涎腺功能損傷的方法，具有十分重要的意義。本文就目前有關放射性涎腺損傷治療的研究進展作一綜述。
1.放射性口乾症的發生機制
涎腺主要是由能夠分泌唾液腺泡細胞，圍繞在腺泡細胞周圍的肌上皮細胞和控制唾液分泌的導管細胞組成。放療會對這些細胞及周圍神經和血管同時造成損傷。將導致細胞空泡性變、組織纖維化及血管密度降低等，造成涎腺功能的受損。早期涎腺放射性損傷的主要原因是由於細胞膜上信號通路受干擾，導致毒蕈鹼型膽鹼受體（muscarinicreceptor，M受體）以及水通道蛋白-5（aquaporin5，AQP5）功能障礙，引起早期唾液分泌急劇減少。晚期由於放療後的延遲損傷效應導致涎腺組織內細胞微環境破壞，引發大量細胞凋亡，特別是涎腺特異性干/祖細胞數目的減少。由於損失的腺泡無法得到及時補充，同時伴隨著不同程度的炎症和組織纖維化，最終導致涎腺功能障礙。
2.涎腺來源的干/祖細胞
Cotroneo等通過結紮涎腺導管的方式使腺體萎縮功能喪失，鬆開導管後，發現受損腺體功能逐漸恢復，唾液分泌量恢復至正常水平，且觀察到部分導管細胞轉化為腺泡細胞。由此推測，一些內源性涎腺細胞可能參與腺體組織的修復再生過程。Chibly等用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）標記滯留細胞，發現一些具有增殖潛力並具有干/祖細胞特性的涎腺細胞，主要存在於涎腺的排泄管和閏管。證實涎腺組織內的確存在內源性涎腺干/祖細胞。研究者已經從鼠涎腺組織內成功分離出涎腺干/祖細胞，並且表達幹細胞特異性表面標誌物。如CD24，CD29，CD49f，CD117/ckit，clusterin和Sca-1。
Feng等也從人腮腺組織中分離具有自我更新能力的c-Kit陽性標記的細胞。Lombaert等利用小鼠下頜下腺（submandibularglands，SMG）細胞在體外進行唾液球培養，發現其中一些細胞特異性表達Sca-1，c-KitandMusashi-1等幹細胞表面標誌物，並且這些細胞可以分化為能夠分泌粘蛋白和澱粉酶的涎腺細胞，同時首次移植小鼠自體c-Kit+涎腺細胞，到小鼠放射性下頜下腺損傷的腺體內（每腺體約100～300個），證實可以長期恢復腺體功能，為涎腺干/祖細胞在放射性涎腺治療中的應用，提供支持依據。
Nanduri等認為涎腺干/祖細胞與周圍血管、基質和神經細胞組成的微環境，兩者之間的相互聯繫對於腺體功能的長期穩定至關重要。而放療會導致細胞微環境失衡，引發實質細胞凋亡，導致腺體功能受損。其通過實驗發現不同類型的c-Kit+細胞亞群（CD24+，CD49f+，CD24+CD49f+）放療損傷後，腺體功能恢復的能力有所差異，其中CD49f+對涎腺功能的恢復無明顯影響，而c-Kit+CD24+CD49f+對腺體功能改善的效果最佳。並證實移植後的c-Kit+不僅可以在放射性損傷後的下頜下腺內長期存活，而且可分化為腺泡細胞和涎腺干/祖細胞，有助於恢復受損腺體組織內微環境穩態，進而有利於腺體功能的恢復。並進一步通過實驗證明體外培養的CD24hi/CD29hi唾液球可以維持長期的細胞增殖及分化能力，且CD24hi/CD29hi擁有具有較高的干/祖細胞潛能。Pringle等則完整闡述了人SMG幹細胞的分離、培養、增殖及分化能力的過程，並通過實驗證實，經小鼠放射性損傷的下頜下腺腺體內注射少量人類c-Kit+細胞（每腺體至少500個），可使受損腺體能得到長期且巨大改善。
涎腺干/祖細胞對於放射性損傷涎腺的修復再生中起著至關重要的有作用，且憑藉自體移植的優勢，避免移植其他細胞可能發生的免疫反應。但臨床中大多數接受放療的患者均為老年患者，獲取的細胞數目有限，其意味著需要更多的干/祖細胞來幫組組織修復。研究人員通過使用生長因子或醛脫氫酶-3在體外刺激c-Kit+細胞的增殖。Neumann等通過冷藏方式將分離出的涎腺干/祖細胞儲存3年之久，仍保持原有的基因穩定性和功能的特異性。
3.非涎腺來源細胞及細胞提取物的治療策略
大量的研究證明細胞治療可改善受損器官功能，主要修復機製為：移植後的細胞部分轉化為相應部位的組織細胞或血管內皮細胞;移植後的細胞通過釋放多種分泌蛋白（如細胞因子、血管生成因子、激素及細胞外基質蛋白及酶等）和包含遺傳物質的囊泡或外泌體（如double-strandedDNA、mRNA、microRNA及lncRNA）發揮旁分泌作用，從而起到抗細胞凋亡、促進細胞增殖和血管生成，並招募內源性幹細胞向受損部位歸巢等作用，幫組組織修復再生。現今，許多研究利用骨髓間充質幹細胞（bonemarrow-derived mesenchymal stemcells，BM-MSCs）、人脂肪來源幹細胞（Humanadipose tissue-derived stemcells，hADSC）、人羊膜上皮細胞（Humanamniotic epithelialcells，hAECs）等，進行放射性涎腺損傷治療的研究。
目前，研究認為移植後的細胞主要通過旁分泌作用，對殘存的涎腺干/祖細胞以及周圍的微環境產生影響，起到保護及促進細胞增殖的作用。Lombaert等通過皮下注射FMS樣酪氨酸激酶3配體、幹細胞因子及G-CSF組合劑（稱為F/S/G）到放射性涎腺損傷小鼠體內，4個月後檢測發現腺體重量、唾液流量以及腺泡細胞數目明顯增加，並發現大量的骨髓細胞迴流至受損腺體內，但尚未觀察到骨髓細胞轉化為腺泡細胞。腺體功能恢復的主要原因可能為「歸巢」後骨髓細胞分泌大量細胞因子，保護並刺激腺體內剩餘干/祖細胞增殖分化。Lim等通過尾靜脈向放射性下頜下腺損傷小鼠體內注射人脂肪間充質幹細胞（humanadipose tissue-derived mesenchymal stemcells，hAdMSCs），發現腺泡細胞凋亡明顯減少，組織纖維化程度降低，並證實注射後的hAdMSCs可在腺體內存活至少4周，並有小部分轉化為可以分泌澱粉酶的腺泡細胞。受損腺體功能恢復的主要原因為hAdMSCs所發揮的旁分泌作用。
An等通過低氧預處理hAdMSCs，測定其分泌蛋白包含多種細胞因子及生長因子（如GM-CSF、VEGF、IL-6和IGF1），含量對比常氧處理組明顯增加。缺氧預處理有助於刺激hAdMSCs的旁分泌，釋放更多有關組織修復和血管再生的細胞因子。並通過實驗經尾靜脈注射hAdMSCs入放射性下頜下腺損傷的小鼠體內，證實缺氧預處理後hAdMSCs分泌的分泌蛋白，可以更好地增強細胞抗凋亡能力且能夠促進細胞增殖。Tran等將骨髓細胞裂解，提取其中可溶性物質，命名為「骨髓湯」（Bonemarrowsoup，BMsoup），通過實驗比較，放射性下頜下腺損傷小鼠腺體原位注射和尾靜脈注射BMsoup的治療效果。證實兩種治療途徑，起到大致相同的治療效果，但原位注射的劑量是尾靜脈注射劑量的1/4。同時測得參與組織修復再生的基因（MMP2，CyclinD1，BMP7，EGF和NGF）水平上調。
目前，關於各類生物活性成分如何有助於細胞旁分泌作用，其生物學機制仍在不斷探究。目前經證實角質形成細胞生長因子可使接受放療後小鼠腺體內干/祖細胞數目增加。WNT/β-catenin和SonicHedgehog（SHH）信號通路也起到相類似作用。應用EGF，IGF1，FGF2，IL6，ALDH3及EDA活化因子，可在不同程度上促進細胞增殖且抑制細胞凋亡。使用荷爾蒙褪黑激素可降低涎腺內氧化應激作用。有學者認為副交感神經對涎腺組織再生起重要作用。有研究表明，放射性涎腺損傷小鼠切除副交感神經後，其腺體功能無法正常恢復。Hai等證明改善副交感神經的支配能力，有助於放射性損傷涎腺功能的恢復。但各類細胞提取的生物活性成分中是否存在神經營養因子，或其中某些成分可直接保護副交感神經，以及可否通過腺體導管逆行注射或者腺體原位注射神經營養因子來改善受損腺體功能，是其機制目前尚需進一步研究。
胚胎幹細胞（embryonic stemcell，ESCs）和誘導多能幹細胞（inducedpluripotent stemcells，iPSCs）兩者相類似，都具有多胚層分化的能力，理論上具有向涎腺細胞分化的潛能。Kawakami等將小鼠ESCs與人涎腺成纖維細胞共培養。1周後發現這些ESCs的形態結構發生明顯變化;PCR檢測發現澱粉酶及bFGF含量明顯增加，將共培養後的ESCs注到正常的小鼠下頜下腺腺體內，1個月後檢測發現移植處新生一些具有腺泡、導管和小葉等類似涎腺的組織結構，證實ESCs具有可轉化為涎腺細胞的能力。HitomiOno等通過將胚胎SMG細胞及iPSCs共培養，在4d後發現iPSCs比胚胎SMG細胞形成更多類似腺泡樣的結構以及更為發達的分支結構，認為iPSCs具有加速腺體分化和再生的能力。因此，通過進一步研究解決ESCs和iPSCs基因組穩定性及成瘤性等問題，二者有望成為治療放射性涎腺損傷的新型種子細胞來源。
4.組織工程涎腺及類器官治療策略
近年來，以細胞治療為基礎的人工涎腺（Artificial SalivaryGland）的構建為放射性涎腺損傷的治療提供了新思路。人工涎腺是指在體外構建一個涎腺樣類器官（SalivaryGlandOrganoids）然後植入體內發揮分泌功能，以達到治療目的。Rookmaaker等認為類器官是一種來源於成體器官，可在體外培養，包含干/祖細胞，具有自我更新和組織特異性分化能力的器官樣結構。類器官培養體系可最大限度的模擬細胞生長所需的各種環境和養分，使細胞能夠在三維立體空間結構中遷移、生長，自我組裝成具有三維特異性結構的類器官樣組織。目前已有眾多關於肺、大腦、胃、肝臟、腎臟、胰腺及前列腺等重要臟器類器官研究的報道，類器官能在結構和功能上模擬或者接近天然器官，其在人類器官發育研究、疾病機制研究尤其是癌症、藥物篩選和器官再生修復等方面均有著重要的研究價值和應用前景。
涎腺組織工程構建涎腺類器官包括3個重要部分：細胞間的接觸、細胞與胞外基質（extracellularmatrix，ECM）的接觸，以及具有良好生物學特性和細胞相容性的三維支架材料。目前支架材料主要有人工合成材料和天然ECM。人工合成材料主要採用人工合成多孔高分子材料如聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）以及兩者之間的各種共聚物。Soscia等在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中通過內襯靜電紡聚乳酸-乙醇酸（PLGA）納米纖維構建高度有序排列的弧形半球狀「坑」，模擬體內唾液腺上皮細胞球形腺泡周圍的基底膜三維結構。並發現改性的PLGA較Matrigel更能促進唾液腺細胞的分化。Chou等研究腮腺腺泡細胞（ParotidGland AcinarCells，PGACs）、成纖維細胞與5種生物材料［殼聚糖、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯-乙烯醇（EVAL）、聚偏氟二乙烯（PVDF）及組織培養聚苯乙烯（TCPS）］的相互作用關係，結果發現PVDF通過調節成纖維細胞釋放NT4促進PGACs表達α-澱粉酶。
Baker等將Par-C10大鼠腮腺細胞系在Matrigel上培養一段時間可以得到類似腺泡樣的具有分泌功能的球形結構。Ogawa等提取13.5～14.5d胚胎期的腺腺上皮組織和間充質組織，分離培養其中的上皮細胞和間充質細胞，將其與含膠原的凝膠一起培養，得到具體唾液分泌功能的涎腺類器官。但人工合成支架材料或者簡單的複合幾種細胞外基質蛋白在支架材料上很難達到模仿天然ECM結構和成分的效果，難以滿足人工涎腺構建的各種生物學特性的需要。因此利用自體天然組織器官脫細胞的方法來構建生物支架逐漸成為一種替代方式。已有學者進行SMG全器官脫細胞後接種原代大鼠SMG細胞的研究。
利用脫細胞組織特異性細胞外基質來支持涎腺前體細胞增殖分化並形成功能性類器官，最大程度保持植入細胞之間，細胞與細胞外基質之間以及細胞與蛋白之間的聯繫，更符合細胞生物學的基本原則。因此，如何更有效的發揮組織特異性ECM促進涎腺細胞及其前體細胞的增殖與分化，並闡明相關調控機制，是涎腺組織工程和再生領域未來研究的一個重要方向。
5.小結
在過去的10年中，關於口乾症的治療取得了顯著的成果，但是如何確定一種最理想的治療方式，仍然面臨著諸多挑戰。首先要解決的是人成體幹細胞在損傷動物模型的應用問題。人類和動物的腺體，存在生物學上的差異，對於放射性損傷的反應機制仍需進一步研究。其次，不同腺體之間的再生及修復能力存在差異（如腮腺、下頜下腺及舌下腺）。另外，由於照射的部位、劑量及患者年齡等自體特異性，將會造成的損傷程度各不相同和治療方案的不同。隨著類器官培養研究的不斷深入，涎腺類器官的培養變得十分可行。未來可通過不同的干預措施，使涎腺類器官模擬涎腺放射性損傷的過程，進一步深入研究放射性涎腺損傷的機制。也可通過對個體細胞來源培養的涎腺組織類器官，進行不同藥物治療療效或者藥物毒性的相關評估，真正實現對每一位放射性涎腺損傷患者的精準且個性化治療。
來源：王英鑫,王帥,張霓霓,黃桂林. 放射性涎腺損傷治療的研究進展[J]. 臨床口腔醫學雜誌,2017,33(11):696-699.
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