外泌體的作用及其在口腔領域的研究展望
本文刊登於《中國實用口腔科雜誌》2018年3期129-133頁
摘要：外泌體是一種區別於微泡具有特異脂質、蛋白、mRNA和miRNA的小的膜性囊泡結構。雖然外泌體提取方法很多，但純度大都不理想。外泌體主要具有細胞間信號傳導、提呈抗原以及誘發和增強機體免疫反應、參與血管新生等功能。文章簡要介紹了外泌體及其在心腦血管、肝臟、腎臟等系統炎症性疾病發生、發展及損傷修復等方面的相關作用，並對其在口腔領域的研究做出一定的前景展望。
關鍵詞：外泌體；組成；提取；檢測；免疫；慢性炎症
外泌體是一種區別於微泡具有特異脂質、蛋白、mRNA和miRNA的小的膜性囊泡結構［1］。它大小均一，直徑為40～100 nm［2］，密度為1.10～1.18 g/mL，最早是在20世紀80年代由Pan等［3］在綿羊紅細胞中發現。從被發現至今的近40年來，許多國內外學者對其進行了深入的基礎研究和臨床應用探討。現對外泌體的來源與組成、提取與檢測、作用及其與慢性炎症方面的關係加以綜述。
1 外泌體的來源與組成
外泌體可由血小板、樹突狀細胞、淋巴細胞、間充質幹細胞和腫瘤細胞等多種類型細胞主動分泌釋放［4］，在大多數體液中都能被檢測到［5］。與一般囊泡不同的是，外泌體不具有質膜而囊泡有質膜［6］。外泌體內主要含有：（1）膽固醇、鞘磷脂、脂筏等［7-8］。（2）四跨膜蛋白、微管蛋白和肌動蛋白結合蛋白。除普遍含有以上3種蛋白外，外泌體可選擇性地攜帶反映其生物起源和細胞來源的特異性蛋白，可反映原始細胞的生理狀態和功能。（3）核酸物質，包括各種mRNA、miRNA及siRNA等 ［9］。
2 外泌體的提取與檢測
根據外泌體的物理特性（密度、大小和溶解度）和生物特性（表面抗原），常用的提取方法主要有4大類：（1）離心法，包括梯度離心、密度離心、旋轉超濾等；（2）過濾法；（3）沉澱法；（4）免疫富集法。雖然可利用的選擇很多，但這些方法處理樣本耗時較長，含雜質蛋白較多，樣本處理通量較低。目前仍沒有一種方法能同時滿足外泌體含量、純度和生物活性的需求。不久前，賓夕法尼亞州立大學的研究人員繞過外泌體的物化特性，採用一種全新的策略——利用脂質分子探針去標記胞外囊泡，只需15 min，分離效率和質量大大提高，堪比超高速離心方法，甚至優於後者 ［10］。根據外泌體的組成及結構，目前常用的鑒定手段如下。（1）形態觀察：利用透射電鏡觀察常呈杯狀，但在體液中常為球形［11］；（2）免疫印跡分析及流式細胞儀鑒定特異性蛋白，包括Alix、Flotillin-1、Lamp-1、Lamp-2、CD63和CD9、HSP70等［12］，其中HSP70和CD63鑒定最多；（3）納米顆粒追蹤技術（nanoparticle tracking analysis，NTA）可用於測量外泌體的大小（40～100 nm）和密度（1.10～1.18 g/mL）［13］。
3 外泌體的作用
目前的研究表明，外泌體具有多種生物學功能，包括去除細胞生長過程中的廢棄蛋白、信號傳導［14］、提呈抗原激活T 細胞以及誘發和增強機體免疫反應、參與血管新生及腫瘤細胞生長等。
3. 1 外泌體的除廢和信號傳導作用 起初，外泌體一直被認為是細胞排棄掉無用的蛋白及RNA的手段，這對於細胞是有利的。但是，後來的研究發現，外泌體微小的體積能夠靈活地避免巨噬細胞的吞噬和穿越血管壁及細胞外基質，及時有效地傳遞信息分子，完成細胞間的信號傳導［15］。Obregon等［16］研究發現，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）數小時後釋放的外泌體刺激正常的單核細胞再培養後，可檢測到單核細胞具有了抗原遞呈的能力。該實驗說明外泌體具有信息傳遞作用。
3. 2 外泌體的免疫作用 不同細胞來源的外泌體含有不同的組成成分，導致其所發揮的作用也略有不同。因此，外泌體對於免疫系統的調控既有促進作用，也有抑制作用。研究發現，DCs來源的外泌體富含主要組織相容性複合體（MHC）-Ⅱ類分子、特異性抗原肽、CD80、CD86等蛋白成分，它們具有抗原呈遞作用，可誘導特異性免疫發揮免疫激活作用。2013年Zhang等［17］的實驗發現，骨髓幹細胞（marrow stromai stem cells，MSCs）來源的外泌體可激活MYD-88依賴的信號通路，使單核細胞轉化為M2表型，進而CD4+ T細胞極化激活成調節性T細胞，從而延遲免疫反應。
3. 3 外泌體的促血管新生及腫瘤細胞生長作用 外泌體的促血管新生作用多見於心臟及腎臟損傷修復中，主要原因是外泌體內含有具有心臟及腎臟損傷修復作用的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。Zhang等［17］構建的缺血模型中，大劑量的MSC來源的外泌體能夠明顯加快血管損傷後血流的通暢；並且一些體外實驗也證實MSC來源的外泌體可以促進內皮細胞的生長和增殖，這些都表明MSC來源的外泌體具有促進血管生成的作用。精氨酸酶-1（Arg-1）等活性分子可以抑制特異性和天然的抗腫瘤免疫，而外泌體能夠高表達它們，從而使腫瘤細胞逃離免疫，達到促腫瘤細胞生長的作用。
4 外泌體在慢性炎症方面的研究
臨床上，我們經常可以在血液循環中發現外泌體，它是細胞對炎症發生的反應性行為，並且數量與川崎病、動脈粥樣硬化、糖尿病和代謝綜合征等常見疾病相關的慢性炎症的嚴重程度有關［18］。
4. 1 心腦血管疾病 目前的研究發現，在動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、缺血性腦卒中和惡性高血壓等一些疾病的血液中都可檢測到內皮細胞來源外泌體的增高，所以內皮細胞在活化或凋亡時所釋放的外泌體，能夠作為血管損傷和功能障礙的標誌物之一［19-21］。Jansen等［22］研究發現，內皮細胞被高糖誘導後釋放的外泌體能夠促進巨噬細胞浸潤及炎性細胞聚集，增加黏附蛋白的表達，從而促單核細胞黏附，起到促炎的作用。Loo等［23］研究還發現，從心肌梗死患者外周血中提取的外泌體作用於Th-1細胞可增加T-βmRNA和相應蛋白的表達，既能促進外周血中CD4+ T淋巴細胞向Th-1分化，又能促進干擾素（INF）-γ和腫瘤壞死因子（TNF）-α大量生成。這些結果都提示我們，某些病理狀態下產生的內皮細胞源性外泌體能夠促進樹突狀細胞及Th-1的分化及功能，從而參與相關的炎症免疫反應。
4. 2 肝臟炎症 在先天免疫系統中，從病毒感染的細胞中釋放出的外泌體包含樹突狀細胞和巨噬細胞的病毒RNA，釋放後可激活受體細胞中的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），如Toll樣受體和RIG-1樣受體，這將導致Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的表達［23-24］。另外，外泌體不僅可以轉運病毒RNA，而且還能將miRNA轉移到受體細胞。據Dreux等［25］報道，丙型肝炎病毒（HCV） RNA被包裹在從HCV感染的肝細胞中釋放的外泌體內，攜帶HCV RNA的外泌體激活pDC，導致Ⅰ型干擾素的產生。除此以外，在其他病毒研究中也檢測到了外泌體內病毒RNA的包裝 ［26］。以上的證據都表明，從被病毒感染的肝細胞中釋放的外泌體可將病毒RNA轉移到受體細胞，包括DCs和巨噬細胞，從而誘導先天的免疫應答。
4. 3 中樞感染性疾病 中樞神經系統的慢性炎症疾病主要由朊蛋白、人類免疫缺陷病毒（human immunodefi-ciency virus，HIV ）、人類嗜T細胞病毒（human T lymphotropic virus，HTLV） 等病原體侵入宿主細胞引起。被感染的宿主細胞分泌的外泌體可包裹病原體的核酸或蛋白，從而提高病原體的感染力或致病力［27］。以朊蛋白為例，正常和異常的朊蛋白均可分泌外泌體，在朊蛋白致病過程中，包裹異常朊蛋白的外泌體起到重要作用，並使該疾病在動物或細胞間傳染［28-29］。據報道，朊蛋白病傳染過程中外泌體攜帶的大量脂筏參與了新的異常朊蛋白的生成［30］。並且，朊蛋白感染神經元後釋放的外泌體miRNA表達譜與正常神經元的不同，這可為該病的早期診斷提供線索［31］。
5 外泌體在口腔領域的研究展望
目前，在口腔領域有關外泌體的研究正在日益增加，從最初的只涉及腫瘤疾病及與自身免疫有關的黏膜病方面，到目前已有報道關於上皮間充質轉化、牙髓組織再生以及牙周膜幹細胞方面的研究，說明外泌體在口腔醫學領域的潛在價值正在被科學家們不斷探索中，而且還有很大的研究空間。
2016年，Sento等［32］從口腔鱗癌細胞中分離出外泌體，它不僅可被口腔鱗癌細胞吸收，也能通過激活體外PI3K / Akt、MAPK / ERK和JNK-1/2途徑促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。然後通過用PI3K、ERK-1/2和JNK-1/2藥物抑製劑作用於相應的外泌體，他們發現外泌體的促腫瘤細胞生長作用明顯減弱。這表明口腔鱗癌細胞釋放的外泌體很可能是一種新的治療靶點，為其臨床治療開闢了一條新的途徑。此外，研究者發現口腔上皮細胞共培養愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV）陽性B細胞時可誘導病毒的再激活，因為來源於口腔上皮細胞的外泌體內含miR-200家族的miRNA，後者可促進EBV裂解複製。口腔上皮細胞分泌的外泌體可作為組織特異性環境線索，啟動B細胞中病毒的再激活，促使病毒從外周B細胞轉移到口腔上皮，以促進病毒擴增和交換到其他宿主。所以這種細胞間通訊途徑可作為B細胞識別合適環境來引發再激活的感測器機制，從而允許病毒與口腔上皮交換［33］。
在人類口腔組織的發育過程中，上皮和間充質的相互作用對於頭頸部皮膚、毛囊、主要腺體和牙齒的發育至關重要。2017年，Jiang等［34］研究了口腔器官發生過程中細胞外泌體在上皮-間充質相互作用中的一些功能。研究表明，發育中的牙齒組織的上皮和間充質可分泌直徑小於100 nm的外泌體，並通過基底膜向外擴散。外泌體相互誘導細胞分化和基質合成：上皮來源的外泌體誘導間充質細胞產生牙本質涎蛋白並進行礦化，而間充質來源的外泌體誘導上皮細胞產生基底膜成分、成釉蛋白和褪黑素。並且上皮來源的外泌體內含miR135a，能激活Wnt /β-連環蛋白信號傳導並增加牙本質基質蛋白的間充質產生和部分可逆的Antago-miR135a減毒。這些都說明外泌體可能介導器官發育中的上皮-間充質轉化，並且外泌體和（或）它們正在運輸的分子內容可能是治療疾病或組織再生的介入。在研究多發性硬化症患者抵禦腦脊髓炎時，研究者發現從健康供體阻斷實驗性自身免疫性腦脊髓炎獲得的人牙周膜幹細胞來源的條件培養基和純化的外泌體，可以減少促炎性細胞因子IL-17、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，並誘導抗炎症細胞因子IL-10的產生。此外，凋亡相關的STAT1、p53、Caspase 3和Bax表達減弱。其研究結果揭示了人牙周膜幹細胞在自身免疫性腦脊髓炎炎症過程中的免疫抑制作用，這也為我們探索人牙周膜幹細胞在口腔慢性炎症過程中發揮的免疫作用提供了一個好的借鑒［35］。
為了規避由於使用生長因子和生長因子遞送系統而引起的眾多問題，科學家們正在探索使用不同來源的外泌體作為仿生工具來誘導幹細胞分化［36］。實驗結果表明，牙髓細胞分泌的外泌體可以結合基質蛋白，如Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白，使它們能夠連接到生物材料。並且牙源性分化細胞和人骨髓來源的基質細胞可通過細胞內吞機制以劑量依賴性和飽和方式吞噬外泌體，並觸發P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。另外，牙髓細胞來源的外泌體也促進牙源性分化所需基因的表達增加。當用牙源性分化細胞在牙根切片模型中進行體內測試時，外泌體誘導了牙髓樣組織的再生。簡單地說，在牙源性條件下分離的外泌體是更好的幹細胞分化和組織再生的誘導劑。這個研究提供的數據可作為我們進一步研究在特定條件下培養的細胞中使用細胞類型特異性外泌體以在靶幹細胞中引起特異性應答的可能性的起點。但這需要進一步的研究來描述由外泌體觸發的早期（內吞作用介導的）和晚期（miRNA介導的）信號傳導機制之間的差異，以理解作用特異性背後的機制。我們可以對外泌體在口腔領域的應用做如下設想：可以大量生產純化的外泌體，凍干並商業化分配用於自體幹細胞和現有的臨床材料，如再生牙髓中的膠原海綿。
外泌體作為細胞間物質和信息交流的重要載體，在心腦血管、肝臟、腎臟等系統疾病的發生、發展及損傷修復方面發揮了關鍵性的作用。在臨床應用中關於外泌體的研究正在如火如荼地進行著，其作為診斷標誌物及藥物載體的應用也正在被深入開發。然而在口腔領域，對於外泌體的相關研究少之又少，外泌體的功能及應用具有很大的潛在研究前景，所以需要我們進行更深入的探索和驗證，以便更多地用於口腔臨床的診斷與治療。
參考文獻 略
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