克羅恩病腸道纖維化的易感基因和血清標誌物
摘要：克羅恩病（Crohn disease，CD）是一種病因不明的腸道慢性遷延性炎性疾病。隨著病程的發展，多數CD患者可出現腸道纖維化並逐步發展為腸道的纖維化狹窄，進而導致難治性腹痛甚至腸梗阻，最終需要一次乃至多次手術治療。目前，CD的病因和發病機制尚不清楚。研究認為，遺傳、環境和免疫三者相互作用參與CD發病，並可能決定CD患者的腸道纖維化發生。近年來，國內外學者對CD遺傳因素的研究發現，基因突變與CD腸道纖維化相關。多項研究表明NOD2、ATG16L1、CX3CR1、IL-23R和MMP3等基因的某些位點突變與纖維梗阻型CD存在關聯性。除遺傳因素之外，血清中的細胞外基質分子、生長因子、miRNAs和微生物抗體等均與CD患者發生腸道纖維化梗阻或狹窄具有相關性，但不同中心的研究結果不甚一致。因此，探索腸道纖維化的無創血清標誌物具有重要的臨床意義。通過高通量的蛋白質組學技術篩選出靈敏度、特異性更高的血清學指標，是一個值得深入研究的方向。通過易感基因篩查出易出現纖維梗阻表型的患者，並結合無創的血清標誌物早期發現腸道纖維化，將有助改善CD的治療效果和降低手術率。本文試對目前關於CD腸道纖維化的易感基因和血清標誌物進行綜述。
克羅恩病（Crohn disease，CD）是一種常見的腸道炎性疾病，其發病原因包括基因、環境因素與免疫，即攜帶易感基因的個體受到外界環境因素影響而誘發的自身免疫異常疾病。CD的病變可累及腸壁全層，炎性反應反覆發作和機體修復失調使得膠原纖維等細胞外基質在腸道中沉積，導致進行性發展的腸道纖維化，最終需要外科手術進行治療。據報道，有超過30%的CD患者在病程中可出現腸道的纖維化狹窄。因此，篩查出腸道纖維化的易感患者並在早期檢測出腸道纖維化的發生和發展，對CD的治療及降低手術率至關重要。本文將對現有研究報道的CD腸道纖維化的易感基因和血清標誌物進行綜述。
01
易感基因
1.NOD2基因：
NOD2（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2，NOD2），NOD2基因是第一個、同時也是研究最多的與纖維梗阻型CD相關的風險基因，其編碼蛋白核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2（NOD2蛋白），又稱CARD15（caspase recruitment domain-containing protein15，CARD15）蛋白，是Apaf-1/NOD1家族的成員之一。NOD2-CARD15蛋白主要表達於單核細胞和巨噬細胞，能夠識別並清除細胞內細菌、介導細胞凋亡和NF-κB的激活及調節腸道防禦因子的表達（如α-防禦素）。NOD2基因的第4、8及11對外顯子上的3個單核苷酸多態性（SNPs：R702W、G908R和3020insC）是最早發現的CD易感基因。但隨後的多個研究發現，這3個SNP在預測CD纖維梗阻表型方面的結果並不完全一致。Heresbach等校正了迴腸受累的影響，並證實R702W是CD發生纖維梗阻的獨立預測因素，這是迄今唯一報道單個R702W突變與CD腸道纖維化相關性的研究。Mendoza等報道了梗阻型CD患者有3.38倍的風險攜帶G908R等位基因的突變，但該研究並未對疾病部位進行校正。在3個SNP中，3020insC和纖維梗阻型CD的關聯最強。多項研究證實了NOD2/CARD15基因突變（即至少攜帶1個SNP）和纖維梗阻型CD的相關性，且攜帶越多SNP發生腸道纖維狹窄的風險越高。值得注意的是，2015年一項納入19 713例CD患者的大型研究未能證實NOD2基因對CD疾病行為的作用。
2.ATG16L1基因：
自噬相關16樣蛋白1（autophagy-related 16-like 1，ATG16L1），ATG16L1屬於自噬小體相關蛋白之一，參與了機體自噬和細菌清除過程。ATG16L1基因的T300A突變（rs2241880）和CD發病之間存在明顯的相關性，該突變可導致潘氏細胞功能障礙和微生物清除受損、NOD介導的炎性反應增強以及內質網的應激。Fowler等對669例CD患者進行了基因型和疾病表型的研究，結果發現T300A突變純合子（GG）和迴腸受累、纖維梗阻型CD顯著相關。而另一項納入1 528例CD患者的歐洲大型研究卻未能證實兩者之間的聯繫。
3.CX3CR1基因：
CX3C趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1），CX3CR1在自然殺傷細胞、單核細胞、CD8陽性T細胞和部分CD4陽性T細胞中均有表達，它可通過結合趨化因子CX3CL1（fractalkine），誘導炎性細胞到達炎性反應部位。CX3CL1屬於趨化因子CX3C家族成員，存在可溶型和膜結合型兩種形式。膜結合型CX3CL1的N端區域存在一個特殊的黏蛋白莖結構，因此還具有粘附表達CX3CR1的炎性反應細胞的作用。CX3CR1基因存在兩個高度相關的SNP，分別是V249I（rs3732379）和T280M（rs3732378）。Brand等發現，CX3CR1基因發生V249I和T280M純合突變的患者出現腸道纖維化狹窄的比例明顯高於野生型和雜合突變的患者，疾病累及回結腸的比例也要更高。在Sabate等的研究中，發現CX3CR1的V249I突變和纖維梗阻型CD明顯相關，且這種相關性在吸煙患者中尤為顯著，而在非吸煙患者中則不存在。進一步的多元回歸分析證實CX3CR1的V249I突變是腸道纖維化的獨立風險因素（風險比達2.4）。
4.IL-23R基因：
IL-23R（interleukin-23 receptor，IL-23R），IL-23R基因編碼了促炎因子IL-23受體亞單位，而IL-23受體亞單位與IL-12受體β1亞單位形成IL-23R複合物。IL-23可以結合細胞膜表面的IL-23R複合物，誘導Th17細胞分化和促進IL-17的分泌。繼Duerr等發現IL-23R基因屬於CD的易感基因，Glas等隨後發現，IL-23R基因發生rs1004819純合突變的CD患者相比野生型的患者而言，疾病累及迴腸以及出現腸道纖維梗阻的風險更高，但這一結果經Bonferroni校正後並無統計學差異。
5.MMP-3基因：
基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活性受到金屬蛋白酶組織抑製劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）的調控，且兩者共同參與了細胞外基質的降解。Meijer等發現，MMP-3 SNP-1613 5T/6T基因位點的5T5T基因型能夠明顯增加CD患者出現梗阻併發症的風險。在腸道狹窄接受手術治療的患者中，狹窄部位和狹窄部位臨近的腸道組織中MMP-3的表達水平明顯上調，甚至在腸管近端切緣中也能觀察到上調的MMP-3，這提示MMP-3可能參與了腸道纖維化的發展和複發。但值得注意的是，在Meijer的研究中，MMP-3基因型5T5T的患者腸道組織中的MMP-3水平並不顯著高於其他基因型的患者。
6.其他基因：
除了上述基因之外，還有個別研究報道過纖維梗阻型CD與下列基因突變有關，包括MHC（major histocompatibility complex）（rs77005575）、TGF-β（transforming growth factor beta）（rs1800471）、MAGI1（membrane-associated guanylate kinase，WW and PDZ domain-containing protein 1）（rs11924265）、JAK2（Janus kinase 2）（rs10758669）、FUT2（fucosyltransferase 2）（rs601338）和IL-12B（interleukin-12 subunit beta）（rs1363670）。
02
血清標誌物
1.細胞外基質分子：
細胞外基質的過度沉積直接參与了腸道纖維化的過程。Simone等發現，梗阻型CD患者血液中的三型膠原N端前肽（N-terminal propeptide of typeⅢ collagen，PⅢNP）水平明顯高於正常人，且在行病變腸管切除術半年後其水平明顯下降。在Koutroubakis等的研究中，與正常人相比，CD患者血液中的層粘連蛋白水平明顯升高，而四型膠原水平則顯著降低，但兩者均與梗阻表型沒有相關性。另有兩項研究發現，血液中纖連蛋白水平越高，CD患者發生纖維化梗阻的風險越高，且在手術切除病變腸管後纖連蛋白水平降低。
2.生長因子：
鹼性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）參與調節了肌成纖維細胞的增殖。纖維梗阻型CD患者血清中的bFGF水平較穿孔型CD和炎性CD高，且和病變腸管的厚度呈正相關。YKL-40，又稱人幾丁質酶3樣蛋白1（human chitinase 3-like 1），是一種巨噬細胞、中性粒細胞活化後分泌的細胞生長因子，能夠促進成纖維細胞膠原蛋白的分泌。Erzin等發現腸道狹窄的CD患者血清中YKL-40的水平明顯高於沒有狹窄的患者，多元回歸分析證實其為腸道狹窄的獨立預測因素。但Koutroubakis等的研究則顯示血清YKL-40水平和腸道是否狹窄無關。
3.miRNAs：
內源性非編碼RNA（microRNAs，miRNAs）是一類長度約為20~23個核苷酸的內源性非編碼RNA，參與了基因轉錄後的負調控。儘管目前尚不明確血液中miRNAs的病理生理作用，但其容易被檢測且在血液中相當穩定，因此具備成為疾病標誌物的潛力。Chen等首先報道，纖維梗阻型CD患者血液中的miRNA-200b水平較非梗阻型CD和正常人明顯升高。而血液中miRNA-29a的水平在梗阻型CD中則呈現明顯的下降趨勢。Lewis等發現，梗阻型CD患者血液中miR-19a-3p和miR-19b-3p水平較非梗阻患者明顯降低，且在多元回歸分析校正病程、疾病活動度、病變部位、性別及年齡等混雜因素之後，血液中miR-19-3p的水平仍然是梗阻型CD的獨立相關因素。Lewis還對55例CD患者進行了中位時間達4年的隨訪，發現11個出現纖維化狹窄的CD患者入組時的miR-19a-3p和miR-19b-3p水平較其它患者，提示這兩個miRNA或許可以用於預測CD腸道纖維化的發生。
4.微生物抗體：
CD患者血液中存在多種微生物相關抗體，包括抗大腸桿菌外膜蛋白C抗體（anti-Escherichia coli outer membrane protein C antibodies，anti-OmpC）、抗假單胞菌相關序列I2抗體（anti-Pseudomonas-associated sequence I2 antibodies，anti-I2）、抗鞭毛蛋白CBir1抗體（anti-bacterial flagellin CBir1 antibodies，anti-CBir1）以及抗多糖抗體包括抗釀酒酵母抗體（anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA）、抗殼二糖糖苷抗體（anti-chitobioside carbohydrate IgA antibodies，ACCA）、抗甘露二糖糖苷抗體（anti-mannobioside carbohydrate IgG antibodies，AMCA）、抗昆布二糖糖苷抗體（anti-laminaribioside IgG antibodies，ALCA）、抗昆布多糖抗體（anti-laminarin carbohydrate antibodies，anti-L）和抗殼質糖苷抗體（anti-chitin carbohydrate antibodies，anti-C）。若干研究結果證實，CD患者血液中針對細菌成分的抗體（anti-OmpC、anti-I2和antI-CBir1）和疾病的纖維梗阻表型有關。ASCA同樣與纖維梗阻型CD相關，而除ALCA之外的其他多種抗多糖抗體（ASCA、ACCA、AMCA、anti-L及anti-C）則均有研究報道與複雜型CD（伴有纖維狹窄或瘺管）之間存在關聯。但這些微生物抗體似乎並不能將纖維梗阻型CD和穿孔型CD區分開來，故它們並非纖維梗阻型CD的特異性標誌物。
除此之外，血液中的ASCA、anti-cBir1、anti-OmpC、ACCA、ACMA和anti-L還可以預測CD併發症（纖維狹窄或瘺管）的發生，而另一項人群研究則發現在ASCA、anti-I2、anti-OmpC及anti-CBir1中，只有ASCA才能夠預測CD併發症。2014年的一篇薈萃分析納入了11項研究，分析結果證實，這4種抗體（ASCA、anti-I2、anti-OmpC及anti-CBir1）在區分CD併發症方面，ASCA的靈敏度最高，而anti-OmpC的特異度最高，且兩種及兩種以上抗體的判別效果優於單個抗體。值得注意的是，Paul等的研究表明，所有抗多糖抗體均和疾病表型沒有關係。
03
小結
30%~50%的CD患者在發病10年內可因腸道纖維化狹窄而接受手術治療，而手術切除病變腸管的患者有一半在術後仍然會再次出現腸管的纖維化狹窄。某些特定的基因背景可能參與其中，使得部分患者易於出現纖維化梗阻的表型，而篩查出這些易感基因將有助於對患者進行風險分層和管理。目前，多數CD基因型-表型的研究樣本量小、患者群體存在差異及對纖維梗阻的定義不一，且未考慮病程長短、病變部位和環境因素的影響。因此，未來的研究應該儘可能地消除這些混雜因素的干擾。在163個炎性腸病的風險易感基因中，部分調節免疫、自噬的基因參與調控了間充質細胞的激活和纖維化的發生，但這些基因並非都有研究報道與纖維梗阻型CD有關。如富亮氨酸重複激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）基因的M2397等位基因可以抑制活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）的活性，而NFAT參與調節了心肌成纖維細胞的可塑性。故LRRK2基因可能同樣參與了腸道纖維化的發生，但目前尚未有研究直接證實其與纖維梗阻型CD的相關性。腸壁的纖維沉積往往是一個不可逆的過程，儘早發現纖維化的發生，對治療干預以及改善患者預後至關重要。故探索腸道纖維化的無創血清標誌物具有重要的臨床意義。目前，包括細胞外基質分子、生長因子、miRNAs和微生物抗體在內的幾種血清標誌物的可靠性及聯合應用的價值還需要更多的研究進行驗證。因此，通過高通量的蛋白質組學技術篩選出靈敏度、特異性更高的血清學指標，是一個值得深入研究的方向。
轉自：胃腸學術平台
來源：中華胃腸外科雜誌
作者：李冠煒 任建安 黎介壽
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