PNAS：利用CRISPR/Cas9開發出一種精準的基因組突變預防系統

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通用的DNA遺傳編碼中的單個鹼基變化可導致或惡化許多危及生命的疾病。這種「點突變」能夠將人體內的細胞轉變為癌細胞，隨後這種癌細胞繼續生長而形成腫瘤，或者它們能夠將將抗生素敏感性細菌轉化為導致不可治癒的感染的抗生素耐藥性細菌。在理想的世界中，臨床醫生應能夠在攜帶著這樣的有害點突變的細胞產生後立即將它們清除，從而更加有效地抵抗疾病。

圖片來自iStock/Meletios Verras。

如今，在一項新的研究中，來自美國哈佛醫學院懷斯生物啟發工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）的研究人員報道通過將CRISPR/Cas9基因組工程系統轉化為一種基因組監測工具，他們已完成實現這個目標的第一步。在懷斯生物啟發工程研究所核心成員George Church和James Collins的領導下，這些研究人員開發出一種體內突變預防方法，這種方法能夠允許切割DNA的Cas9酶區分相差單個鹼基的基因組靶位點，並且僅切割不想要的靶位點。針對體外培養的或在小鼠胃腸道內定植的大腸桿菌菌株開展的概念驗證研究中，這種方法能夠阻止抗生素耐藥性細菌變體存活。相關研究結果近期發表在PNAS期刊上，論文標題為「Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention」。

嚮導RNA（gRNA）通過鹼基互補配對將Cas9酶引導到它的基因組靶序列上。一旦到達感興趣的位點上，Cas9就像一把分子剪刀，在指定的位點上切割靶序列。如果加以修復的話，那麼這種故意引入的DNA損傷允許生物學家們編輯細胞的基因組，但是如果不加以修復，它將導致細胞死亡。然而，鑒於CRISPR/Cas9系統在許多有機體的基因組中尋找和切割靶序列的效率，讓Cas9在次級位點而不是在完全相同的位點上隨機切割的非特異性仍然給基因組工程師帶來問題。這也意味著Cas9通常不能夠充分地區分攜帶不想要的點突變的靶序列和它們的正常靶序列，也就不能夠選擇性地加以清除。即便是設計出的特異性更好的定製Cas9酶迄今為止也不能完全解決這個問題。

Church說，「通過著重關注gRNA的特徵，我們的方法將Cas9的特異性顯著提高到能夠清楚地區分單核苷酸多態性並且能夠清除不想要的基因變體的水平。我們的方法為在未來預防疾病開闢了一條全新的途徑。」

之前的研究已表明gRNA與它的靶序列之間存在的某些不匹配不會影響Cas9切割DNA中的特定位點的能力。論文共同第一作者Alejandro Chavez 博士說，「我們猜測對一對給定的僅相差一個鹼基的靶位點而言，在gRNA中鑒定出的一組錯配將會消除Cas9對正常的靶序列的切割活性，但會維持著對攜帶有害點突變的靶序列的較強活性。這將在攜帶著點突變的細胞產生後阻止它正常運轉。」

為了開發這種方法，這些研究人員利用了致病菌的酶中已知的導致它們對抗生素產生耐藥性的點突變。通過關注其中的幾種點突變並篩選具有不同錯配組合的gRNA變體，他們能夠鑒定出促使Cas9特異性靶向發生突變的基因序列但不靶向正常基因序列的gRNA。

論文共同第一作者Benjamin Pruitt說，「這種突變預防系統不僅在標準實驗室條件下培養的大腸桿菌菌株中維持抗生素敏感性，而且在用於定殖於無菌小鼠胃腸道的細菌中也維持抗生素敏感性。這些持續多天的小鼠實驗涉及持續地讓這些小鼠服用一定劑量的抗生素，並證實即使在遭受潛在重大的環境壓力時，這種系統仍然是非常有效的。」

這些研究人員認為，他們的突變預防系統除了有潛力用於未來的疾病預防之外，還可能馬上協助生物技術行業阻止大規模培養的細菌發生導致它們沒有生產效率或易被污染的突變，並研究微生物進化。」

原始出處：

Alejandro Chavez, Benjamin W. Pruitt, Marcelle Tuttle et al. Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention. PNAS, Available online 19 March 2018, doi:10.1073/pnas.1718148115

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