Pan-negative型非小細胞肺癌的研究進展
摘要
近年來隨著對腫瘤驅動基因的不斷探索和分子檢測技術的快速發展，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）領域，一系列的驅動基因如EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK和ROS-1等相繼被發現，並逐漸研發出相應的針對特定驅動基因變異的靶向治療藥物，使NSCLC患者的生存得到極大改善。儘管如此，仍有部分NSCLC患者未能檢測到任何已知驅動基因變異，稱之為pan-negative型NSCLC。本文就pan-negative型NSCLC的概念、臨床病理和流行病學特點以及治療預後等作一綜述。
非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約佔肺癌患者的85%，是世界範圍內癌症相關死亡的主要原因[1]。隨著分子檢測技術不斷提高，越來越多驅動基因被發現。研究[2]表明，70%以上的NSCLC具有明確的驅動基因，包括EGFR、ALK、ROS-1、BRAF、KRAS、MET、PIK3CA、RET、HER-2和MEK1/2基因等。針對一些驅動基因變異的靶向藥物相繼上市，如治療EGFR基因敏感突變的厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼，以及EGFR T790M耐葯突變的奧希替尼；針對ALK和ROS-1基因重排的克唑替尼、色瑞替尼（ceritinib）和阿雷替尼（alectinib）；以及針對BRAF V600E突變的達拉菲尼（dabrafenib）和曲美替尼（trametinib）聯合療法等，具體參見表1。肺鱗癌中約有20%攜帶有FGFR1擴增，約2%發生DDR2突變。DDR2突變的肺鱗癌對達沙替尼（dasatinib）具有一定敏感性[3]。相比傳統化療，靶向藥物應答率更高，患者無進展生存時間（progression-free survival, PFS）更長。目前針對其他驅動基因變異的靶向治療藥物也在臨床實驗中不斷探索[4]。儘管如此，目前仍有部分NSCLC患者即便採用新一代測序技術（next generation sequencing, NGS）對其全基因組分析檢測，仍然檢測不到任何驅動基因變異，稱之為pan-negative型NSCLC。本文就pan-negative型NSCLC患者的概念、臨床病理和流行病學特點及治療預後等作一綜述。
表一
1 Pan-negative概念
研究表明，NSCLC不同組織類型的驅動基因分類差別較大。肺腺癌的主要驅動基因變異有EGFR、HER2、KRAS/NRAS、BRAF、PI3KCA和HER-2等基因突變，ALK、ROS1和RET基因重排，以及MET基因擴增等[2]；肺鱗癌的主要驅動基因包括FGFR1、DDR2、SOX、MDM2、PDGFRA和P53等基因突變、PTEN缺失等[5-9]。儘管目前已經發現上述多種肺癌驅動基因變異，但仍有部分NSCLC患者未檢測到任何驅動基因變異。這種癌組織或細胞經全基因組序列分析或聯合蛋白水平檢測未發現任何目前已知的驅動基因變異的肺癌類型被稱之為pan-negative型NSCLC。
「Pan-negative」一詞最早見於黑色素瘤和NSCLC中。Hutchinson等曾描述大約35%的黑色素瘤被認為是廣泛陰性的（Pan-negative），即缺乏已知驅動基因BRAF、NRAS、KIT、GNAQ、GAN11中的任何一種變異[10]。2010年上海復旦大學腫瘤醫院對52例不吸煙肺腺癌術後標本採用序列分析，檢測其EGFR、HER2、KRAS、BRAF、TP53、LKB1、PIK3CA突變以及ALK融合。結果發現有接近10%的標本缺乏驅動基因變異。該團隊將這類經測序方法檢測不到已知驅動基因變異的肺癌類型稱之為「pan-negative」肺癌[11]。2012年Li等[12]利用全外顯子序列（Affymetrix Exon 1.0）分析方法重新檢測上述「pan-negative」肺癌標本並對可能存在的融合激酶進行熱譜分析，結果發現在這些「pan-negative」肺癌標本中發現其中1例存在RET融合，1例存在ROS1融合，因此這52例肺癌標本的驅動基因陰性比例由9.6%變成5.8%。因此pan-negative狀態並非固定不變，尤其是在疾病進展或經治療後，應考慮到其空間異質性和時間異質性，即個體同一疾病的任一空間病灶或任一時間點檢測出驅動基因變異均可以排除此時pan-negative狀態。正如目前所報道的pan-negative的病例大多為肺腺癌中未檢測到某些特定驅動基因變異，每篇報道所檢測的驅動基因數目也不盡相同，從幾個到十幾個不等。因而，這種在癌組織/細胞中未檢測出任何預先規定的驅動基因變異類型，我們稱之為狹義的pan-negative型NSCLC（需要指明特定組織和標本類型）。
2 Pan-negative型NSCLC流行病學特點
由於各項研究的病例樣本、人群分布、檢測手段，以及檢測驅動基因變異數目的差異，造成pan-negative型NSCLC的檢出率並不一致。對pan-negative型肺腺癌和肺鱗癌的國內外流行病學研究情況分述如下。
2013年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）會議上，美國肺癌突變聯盟（Lung Cancer Mutation Consortium, LCMC）報道了一項肺腺癌基因變異譜的研究，對1,007例IIIb期或IV期肺腺癌患者進行了10種已知癌症驅動基因的檢測（包括KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA、AKT1、MEK1、NRAS突變，ALK重排和HER2、MET擴增）。結果發現，在773例肺腺癌中，高達36%的樣本未檢測出上述已知的驅動基因變異[13]。另一項是Philip團隊針對美國非洲裔NSCLC患者驅動基因譜的研究，對10個已知驅動基因（包括EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、AKT1、PIK3CA、PTEN、ERBB2和MEK1基因突變，ALK重排）進行了檢測，結果發現非鱗型NSCLC中pan-negative的比例為22%（35/161）[14]。此外，法國生物標誌物研究（BM）團隊開展了迄今為止樣本量最大的驅動基因變異譜研究，對10,000例生物標記物數據進行了6個已知驅動基因變異（包括EGFR、KRAS、BRAF、HER2和PIK3CA基因突變，ALK基因重排）的檢測，結果發現高達55%的樣本屬於基因變異未知人群[15]。Custom研究是首個評估生物標誌物配對治療療效的前瞻性臨床研究，檢測入組的482例NSCLC患者的已知驅動基因（包括EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF、HRAS1、ERBB2、AKT1、NRAS基因突變，HER2擴增，PTEN缺失，ALK重排），發現pan-negative型NSCLC比例達36%[16]。
國內研究方面，2012年吳一龍團隊採用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）和直接測序等方法對524例NSCLC的10個驅動基因變異（包括EGFR、KRAS、BRAF、STK11、PIK3CA、DDR2、FGFR2基因突變，PTEN缺失、MET擴增、ALK重排）進行了檢測，結果顯示只有10.9%的患者未檢測出明確的驅動基因變異[17]。另一項中國的研究來自上海復旦大學癌症中心，研究者同樣採用PCR和直接測序等方法檢測了近兩千例NSCLC患者癌組織的7個驅動基因變異（包括EGFR、KRAS、HER2、BRAF基因突變，ALK、ROS1、RET融合）。在1,356例肺腺癌當中，pan-negative的比例佔17.3%[18]。而對於不吸煙的肺腺癌患者，Li等[19]報道了只有12%（24/202）的東亞裔不吸煙肺腺癌患者未能檢測出任何驅動基因變異。該研究還發現存在未知基因突變的患者與具有已知突變的患者相比年齡偏小（52.3歲 vs 57.9歲，P=0.013）。
從上述國內外的研究顯示，東西方pan-negative型肺腺癌發生率有所差異，東亞裔pan-negative型NSCLC的發生率（10%-20%）似乎低於高加索人群（20%-50%）。關於pan-negative型肺腺癌的臨床病理特徵目前尚缺乏準確的大宗數據報道，有待於進一步研究證實。現階段的普遍認識是，pan-negative型肺腺癌是一個獨特的分子亞型，可能具有不同於其他肺腺癌的臨床病理學特徵。
關於肺鱗癌驅動基因的研究也從未停止。最近一項日本的前瞻性肺鱗癌驅動基因變異譜研究，檢測了129例肺鱗癌和腺鱗癌患者的12項基因變異（包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、NRAS、MEK1、AKT1、HER2和DDR2基因突變，ALK重排，PTEN缺失，ROS1融合），發現大約50%樣本未檢測出上述驅動基因變異。不同的標本類型檢測結果不同，石蠟包埋的標本基因變異檢出率低於術中快速冰凍標本（29% vs 50%）。該研究中還發現在鱗癌和腺鱗癌人群中pan-negative發生率與患者年齡和吸煙狀態有關，年齡大於70歲（48% vs 35%）和吸煙者（78% vs 10%）pan-negative發生率高[20]。美國國家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI）與美國西南腫瘤組（Southwest Oncology Group, SWOG）牽頭推出了生物標誌物驅動的肺鱗癌新葯的前瞻性研究（lung-MAP, SWOG S1400），基於晚期肺鱗癌的5個基因檢測結果將患者分配到5個子研究中。在這些子研究中，患者或接受標準治療或接受針對相應基因變異的靶向治療。該研究有望為有關肺鱗癌的驅動基因及靶向治療帶來新的答案[21]。
3 Pan-negative型NSCLC的治療及預後
LCMC的一項針對肺腺癌驅動基因變異譜的研究顯示，篩查到驅動基因變異且接受相應靶向治療者、篩查到驅動基因未接受靶向治療者，以及無驅動基因無靶向治療者的中位OS分別為3.5年、2.4年和2.1年，提示pan-negative型NSCLC預後生存並不比含有驅動基因的患者預後差[13]。表2所列為Pan-negative型NSCLC目前國內外各指南推薦的治療模式選擇。
表二
3.1 一線治療
在一線治療中，KEYNOTE-024研究證實在未經治療且PD-L1表達強陽性（≥50%）的NSCLC患者中，無論是ORR、PFS還是OS，帕姆單抗（pembrolizumab）均顯著優於傳統的一線含鉑兩葯化療方案，且安全性更好[22]。基於該研究，NCCN指南目前推薦帕姆單抗為PD-L1表達強陽性NSCLC一線首選治療。
針對PD-L1
業已證實，EGFR野生型NSCLC大多不能從EGFR-TKI治療中獲益，但EGFR信號通路仍然在EGFR野生型肺癌細胞的增殖、侵襲和轉移中扮演重要角色。EGFR單抗，如西妥昔單抗和necitumumab等，可與腫瘤細胞表面EGFR有效結合，抑制EGFR下游信號通路。FLEX研究首次證實，對經免疫組化證實EGFR強陽性的晚期NSCLC患者採用西妥昔單抗聯合化療（順鉑和長春瑞濱）相比單純化療，OS得以改善（12個月 vs 9.6個月，P=0.011）[28]。2017年Lancet Oncology發布的III期臨床研究SWOG S0819中，在標準化療基礎上聯合西妥昔單抗並不能延長EGFR FISH陽性晚期NSCLC患者的PFS和總體人群的OS[29]。因此，西妥昔單抗在NSCLC治療中的價值及獲益人群還有待進一步探索。Necitumumab也是一種重組人抗EGFR單克隆抗體。在SQUIRE研究中，採用necitumumab聯合化療（吉西他濱和順鉑）對比單純化療一線治療局部進展期或轉移性鱗型NSCLC獲得了1.6個月的OS改善和0.2個月的PFS改善。據此FDA批准了necitumumab與吉西他濱和順鉑聯合方案用於一線治療局部進展期或轉移性鱗型NSCLC[30]。
3.2 維持/鞏固治療
在一線化療4周期-6周期後，如腫瘤達到緩解或穩定，已有多項研究證實可予以繼續或換藥維持治療（表2），延長患者PFS和OS[31-33]。2013年Cai等[34]對同葯或換藥維持治療的研究進行了薈萃分析。首先，按同葯或換藥維持劃分，發現原葯或換藥維持均顯著改善患者PFS，原葯維持具有改善OS趨勢，但無統計學意義，而換藥維持能夠顯著改善患者OS。其次，按組織類型劃分，非鱗癌亞組在OS和PFS方面均有顯著改善，但鱗癌亞組並沒有看到OS和PFS顯著獲益。Kulkarni等[35]對NSCLC維持治療獲益人群進行回顧和薈萃分析，研究共納入14項維持治療的隨機對照試驗。得出最佳OS獲益人群為接受培美曲塞維持治療的非鱗NSCLC患者（HR: 0.74; 95%CI: 0.64-0.86; P
3.3 二線/後線治療
TAX317/320研究奠定了多西他賽在NSCLC二線治療的標準地位[40,41]，而JMEI研究也奠定了培美曲賽在非鱗型NSCLC二線治療中的地位[42]。在EGFR基因狀態未選擇的患者中，INTEREST和TITAN研究顯示，EGFR-TKI（厄洛替尼、吉非替尼）與傳統的標準二線化療（多西他賽、培美曲賽）療效相似。回顧性分析表明，厄洛替尼二線治療EGFR野生型NSCLC也有一定療效[43-45]。對於體力狀態差、無法耐受化療的患者，厄洛替尼成為這部分NSCLC二線治療的選擇之一。然而， 後續多項研究（DELTA, TAILOR, CTONG0806）顯示，對於E G F R 野生型NSCLC患者，二線化療（多西他賽、培美曲賽）無論是ORR和PFS都顯著優於EGFR-TKI治療[46,47]。在III期LUX-Lung 8試驗研究中，直接比較阿法替尼和厄洛替尼在一線化療後發生進展的晚期肺鱗癌患者中接受這兩種EGFR靶向藥物的療效和安全性， 結果顯示，阿法替尼治療可使死亡風險明顯降低（19%），並使患者的中位生存期延長達7.9個月，超過厄洛替尼（6.8個月）；因此對於美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）評分2分的晚期肺鱗癌患者，阿法替尼成為二線治療的推薦選擇之一[48]。
免疫治療已經成為一線化療失敗後新的標準二線治療推薦。目前FDA已經批准上市的免疫檢查點類藥物，如納武單抗（nivolumab）、帕姆單抗（pembrolizumab）（限於PD-L1≥1%患者）和阿特珠單抗（atezolizumab），無論是鱗癌還是腺癌二線治療OS都顯著優於傳統化療藥物多西他賽，中位OS延長3個月-4個月[49-52]。一項網路薈萃分析研究對EGFR野生型或狀態未知的進展期NSCLC的不同二線治療方法進行了薈萃分析，共納入102項隨機對照臨床試驗的36,058例患者，結果發現，納武單抗、帕姆單抗、阿特珠單抗及厄洛替尼聯合培美曲賽能夠更有效的延長患者生存[53]。仍有許多免疫治療聯合化療的臨床研究正在進行。
雷莫蘆單抗是一種人血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）拮抗劑。一項III期隨機對照臨床試驗（REVEL研究）對比了雷莫蘆單抗聯合多西他賽與多西他賽單葯二線治療轉移性NSCLC患者的療效，結果發現聯合組中位PFS延長1.5個月，中位OS延長1.4個月[54]。
4 Pan-negative型NSCLC的展望
隨著分子檢測技術的發展，一些原本定義為pan-negative型NSCLC的患者也檢測到某種驅動基因變異，這種患者可以給予相應的靶向藥物治療。Ali等[58]通過NGS法檢測了386例肺癌FFPE（石蠟包埋組織）樣本，發現在248例（68%）樣本中至少1個基因變異會被目前的「熱點分析」所遺漏。Drilon等[59]對35例pan-negative型（EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、PIK3CA、MEK1陰性及ALK 融合均陰性）不吸煙肺腺癌進行了RT-PCR或NGS檢測，31%患者存在RET或ROS1融合，其中15%（5/34）患者存在ROS1融合，1例患者應用克唑替尼（crizotinib）達到PR；15%（5/33）存在RET融合，其中3例患者接受了卡博替尼（cabozantinib）治療，2例達到了PR。除了檢測技術的原因之外，pan-negative狀態還應考慮到空間和時間異質性的影響。
總之，儘管目前化療仍是pan-negative型NSCLC治療的基石，但抗PD-1/PD-L1單抗等免疫檢查點類藥物已成為一線化療失敗後的二線治療新的標準，甚至在PD-L1高表達肺癌患者的一線治療中顯示出了顯著的OS獲益以及良好的安全性。可以預見，將來必定會有更多的驅動基因及腫瘤相關的異常信號通路被發現，開發出相應特異性的靶向藥物和信號通路抑製劑。今後研究的方向將是如何更好的發揮免疫檢查點藥物的優勢，努力尋找療效預測分子標誌物以提高免疫治療的精準性。此外，要積極探索免疫檢查點藥物與其他治療方式或其他藥物的聯合應用，包括免疫藥物之間的聯合，免疫藥物與放療的聯合，免疫與化療和抗血管藥物之間的聯合，以及免疫治療抑製劑（CTLA-4抑製劑和殺傷細胞免疫球蛋白樣受體KIR抑製劑）和免疫治療的聯合，以期進一步提高pan-negative型NSCLC治療療效，使之成為新的標準治療。
[[孫麗, 熊志成, 韓琤波.中國醫科大學盛京醫院腫瘤內科. Pan-negative型非小細胞肺癌的研究進展. 中國肺癌雜誌, 2018, 21(2):129-138.]
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