中、澳、美學者合作揭示糖尿病與血栓疾病的新關聯：機械力的黑暗面

撰文居理寧 陳昀峰

在新時代，心血管疾病特徵逐漸呈現糖尿病、肥胖症和代謝綜合症的併發症之中。自我調節機制被打亂，血小板變得過度活躍，這些過度活躍的血小板容易黏附和沉積在未受傷的動脈血管壁表面，加速動脈粥樣硬化。如果不能及時發現和治療，將導致包括血栓、中風、冠心病等心血管類疾病。據2014年中國心血管病報告統計，全國大概有心血管病患者 2.9 億，死亡率為 255人/10 萬人；每年約 350 萬人死於心血管病，佔總死亡人數的40% 。更令人焦心的是，該報告預測未來十年里伴隨著社會經濟發展和國民生活方式、體質、人口年齡比例的變化，中國心血管疾病的患病人數還會快速增長。

2004年，著名美國心臟學家 Valentin Fuster 及同事提出了一條讓世人震驚的預測：「在2000年出生的新生兒，每三個會有一個將在其人生中罹患糖尿病，而其最直接的危害就是會減短他們30%的壽命」 [1]。目前中國糖尿病患者人數已達1.14億，居全球首位。而約70%的糖尿病患者最終將死於由血小板引發的血栓所造成的心臟病或者缺血性腦中風 [2]。我們知道糖尿病可以造成血小板的生物化學變異，使其更為活化，從而更容易形成黏性血凝塊，但是其內在機理目前仍不清晰。更為可惜的是，目前常用的抗血小板藥物皆在抑製糖尿病血小板的活性上效果尚不理想。因此，理清糖尿病對血小板的活化影響的機理，並開發更有效的治療手段刻不容緩！

近日，來自澳大利亞悉尼大學的 Shaun Jackson 團隊與美國喬治亞理工的朱承團隊展開交叉學科合作項目，旨在研究生物機械力對於血小板活化的調控作用及其和糖尿病所導致的血栓疾病之間的關聯。他們最近發現一種血小板壓力感應新機制，啟發糖尿病引發心血管疾病的治療方案，目前已發表在《自然·通訊》雜誌 [3]。

血液循環中的細胞—血小板發生活化是造成血栓疾病的罪魁禍首。血液動力學作用力在血小板形成血栓的過程中有重要作用[4]，但是之前的研究並沒有探討它與糖尿病之間的關係。與前人側重糖尿病血小板在生物化學方面的變異不同， 該研究在血小板上首次發現了一種「擠壓力感應機制」：血小板通過對環境里擠壓力的感知來調控其表面整合素分子的黏附作用。而這一生物力學機制在糖尿病的情況下被嚴重擾亂，從而導致在流動環境下，血小板藉助整合素進行的黏附和聚合作用都更為快速穩固。考慮到糖尿病與心血管疾病的緊密聯繫，我們推斷本工作所發現的糖尿病對血小板擠壓力感應機制的擾亂或許說明，糖尿病血小板具有一種非典型性的血栓關聯性，使得它對常用抗血小板藥物，例如阿司匹林、氯吡格雷等等，產生可觀的抗藥性[5]。

令人振奮的是，在這項工作中研究者使用了一種自主研發的 I型磷脂醯肌醇3-激酶（PI3-Kinase）110b抑製劑TGX221[6]。體內和體外試驗都成功表明 TGX221可以有效減弱血小板對擠壓力的敏感性和生物力學刺激所導致的整合素激活， 這一重要發現或將啟發我們開發針對糖尿病引起的心血管疾病的新型療法（圖1）。目前TGX221 已經完成一期臨床試驗，並被英國製藥公司阿斯利康（AstraZeneca）收購改名AZD6482。 2012年阿斯利康公司發表了第一份臨床報告[7, 8]。

圖1： 體內針刺血栓模型，該技術利用一根微米級的玻璃針扎進小鼠的血管腔內，造成血流擾動。血栓將在針尖處成形並隨時間擴大規模，而其主要組成細胞為橢圓形血小板。血流中的紅細胞不斷地對血栓中的血小板產生撞擊。在同一時刻，我們對非糖尿病小鼠和糖尿病小鼠體內的血栓表面積進行測量和比較。對於糖尿病小鼠，我們也對其進行TGX221 (2.5 mg kg-1)或阿司匹林/氯吡格雷（Asp/Clop）注射以觀察這些藥物對血栓形成的影響。此外，我們也在PI3Kβ-/-糖尿病小鼠上進行了對比。

這項研究由來自中國，澳大利亞和美國一共16位科研人員歷時八年完成，他們分別任職於以下六所國際化研究中心：

悉尼大學心臟研究所 ；

莫納什大學澳大利亞血液疾病研究中心 ；

Baker 心臟研究所 Danielle Alberti 糖尿病併發症研究中心；

喬治亞理工學院 Coulter 生物醫學系；

埃默里大學兒科內分泌系

斯克里普斯研究所分子醫學系

值得一提的是，其中最年輕的兩位主力居理寧（31歲，第一作者）、陳昀峰（28歲，共同作者）本科先後畢業於北京大學工學院，博士師從喬治亞理工學院朱承教授，目前分別在悉尼大學心臟研究所和斯克里普斯研究所從事相關方向的博士後研究（圖2，三人照片）。近年來三人推廣了第二代生物膜測力儀(Biomembrane Force Probe，BFP) 用於研究血液細胞——主要是血小板與白細胞——上的單分子力感應機理 [9]。 該團隊將生物膜測力儀與熒光顯微鏡結合，實現在活細胞上同步獲取力譜和鈣離子信號 [10]。通過在血小板系統上優化該技術，他們率先刻畫了血小板糖蛋白Ib-IX受體傳導力信號的力學機制[11]。2017年他們進一步將系統升級為雙載生物膜測力儀(dual BFP)用於刻畫兩對受體之間的信號串擾（「crosstalk」）過程。該系統首次在單細胞上實現對上下游受體行為在時間和空間上分開量化[12]。與常規的生物化學和細胞生物學方法（通常是群體平均的和非實時的）不同，雙載生物膜測力儀通過生物力學的手段對實現對多個受體的串擾行為精確控制和量化。該系統在這項研究中充分發揮威力，提供最直接證據證明壓力感應的閾值存在並揭示糖尿病血小板壓力感應發生異化（圖3）[3]。

圖2 在本工作中推廣了第二代生物膜測力儀（照片左側）的三人照片：居理寧（後左一）、陳昀峰（後右一）、朱承（前排）。在本工作中，生物膜測力儀是研究血小板如何在止血過程中感應機械力刺激的主要技術手段。

本工作的核心內容總結為：

· 發現小鼠和人類的慢性高血糖症均會造成其尚未活化的血小板表面整合素αIIbβ3黏附能力的提升。而出人意料的是，這種黏附能力的提升和血液中的紅細胞有著緊密的聯繫。

· 通過運用單分子生物膜力學探針(BFP)對單個血小板的屬性進行刻畫，發現當擠壓力施加在血小板表面時將會激活其表面整合素αIIbβ3，使其和纖維蛋白之間的耦合速度大幅提升，從而可以輕易實現血小板與纖維蛋白的緊密黏附（圖3）。

· 上述這種由機械力造成的整合素激活需要鈣離子和磷脂醯肌醇3-激酶進行信號傳遞，而糖尿病正是通過增強這一信號傳遞過程造成血小板表面整合素αIIbβ3的過度活化和血小板黏附能力的過度強化。

· 通過開展小鼠體內血栓模型實驗，證實了糖尿病會引起尚未活化的血小板在血管中的聚合，其過程所倚賴的是一種生物力學機制。正常治療劑量的阿司匹林、氯吡格雷均不能對這種生物力學機制產生抑制作用，但是如果抑制磷脂醯肌醇3-激酶則可以對其產生有效的阻斷（圖1）。

這項工作開發了一系列原創性實驗手段，包括：1）體內針刺血栓模型，該實驗手段證實了在糖尿病小鼠的體內，血流沖刷力確實能提升血小板形成血栓的能力（圖1）；2）單分子生物膜力學探針(BFP)，運用該技術手段我們發現，血小板通過表面表達的整合素進行的細胞黏附，其強度在一定擠壓力下會受到激發，得到顯著提升，但是如果機械壓力低於某一閾值則無法激發（圖3）；3）體外流動腔實驗，運用該技術研究者發現血液中的紅細胞能提高血小板的黏附能力，但對於糖尿病血小板的黏附能力增幅的作用更為顯著。

文中的主要發現均在多個研究中心獲得多位研究人員佐證，以確保其穩定性和可重複性。另外，工作的科學嚴謹性也反映在研究的實驗設計上——研究有意通過收集多條平行證據的方法對主要結論進行有力支持，其中採用了不同的實驗手段，包括對單個血小板進行的力譜分析、全血體外流動腔實驗和小鼠體內血栓活體顯微鏡成像實驗。這些多樣性的實驗技術在人體細胞和小鼠體內所得到的實驗結論具有高度一致性，並均無一例外地支持文章的主要結論。

圖3：單載和雙載生物膜測力儀介紹和血小板壓力感應實驗結果

參考文獻

1.Moreno, P.R. and V.Fuster, New aspects in the pathogenesisof diabetic atherothrombosis. J Am Coll Cardiol, 2004. 44(12): p. 2293-2300.

2. Jackson,S.P., Arterial thrombosis--insidious,unpredictable and deadly. Nat Med, 2011. 17(11): p. 1423-1436.

3. Ju,L., et al., Compression force sensingregulates integrin alphaIIbbeta3 adhesive function on diabetic platelets.Nat Commun, 2018. 9(1): p. 1087.

4. Nesbitt,W., et al., A shear gradient–dependentplatelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med, 2009. 15(6): p. 665-673.

5. McFadyen,J.D. and K. Peter, Novel AntithromboticDrugs on the Horizon: The Ultimate Promise to Prevent Clotting While AvoidingBleeding. Circ Res, 2017. 121(10):p. 1133-1135.

6. Jackson,S.P., et al., PI 3-kinase p110beta: a newtarget for antithrombotic therapy. Nat Med, 2005. 11(5): p. 507-514.

7. Nylander,S., et al., Human target validation ofphosphoinositide 3-kinase (PI3K)beta: effects on platelets and insulinsensitivity, using AZD6482 a novel PI3Kbeta inhibitor. J Thromb Haemost,2012. 10(10): p. 2127-36.

8.Jackson,S.P. and S.M. Schoenwaelder, Antithromboticphosphoinositide 3-kinase beta inhibitors in humans: a "shear" delight! JThromb Haemost, 2012. 10(10): p.2123-6.

9. Chen,Y., et al., Receptor-mediated cellmechanosensing. Mol Biol Cell, 2017.

10. Chen,Y., et al., Fluorescence BiomembraneForce Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics andBinding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. J Vis Exp,2015(102): p. e52975.

11. Ju,L., et al., Cooperative unfolding ofdistinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife,2016. 5.

12. Ju,L., et al., Dual Biomembrane Force Probeenables single-cell mechanical analysis of signal crosstalk between multiplemolecular species. Sci Rep, 2017. 7(1):p. 14185.

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