兩種土壤細菌群落結構高通量絕對定量方法
1. 研究背景
在宏觀生態學研究中，物種的種類、物種絕對含量和物種相對丰度是描述群落結構的三個必備指標。聚焦土壤微生物生態研究，高通量測序分析技術極大拓寬了我們對微生物群落結構及功能的認識。但目前高通量測序分析結果往往只有微生物分類及其相對丰度，而不同分類水平微生物的絕對含量卻不能獲得。微生物的相對丰度只表徵了一個樣本中微生物類群的相對比例，但目前大多數研究往往誤用相對丰度來進行跨樣本間微生物丰度的比較，當樣本間總微生物絕對含量存在差異時，可能會得出相反的結論（圖1）。為解決高通量測序分析技術的這一局限性，本文將介紹兩種土壤細菌群落結構高通量絕對定量方法（HAAQ, High-throughput Absolute Abundance Quantification），為實現「宏觀微生物生態」更完整、深入的研究提供新方法。
圖1 相對丰度與絕對含量跨樣本比較差異示意圖
2. 方法流程
方法一[1]：向供試土壤中添加適量的（105~107個細胞/克干土）內標菌株Escherichia coliO157:H7 HAAQ-GFP，混勻後提取土壤DNA，然後進行16S rRNA基因高通量測序分析。根據內標菌株HAAQ-GFP已知的絕對量及其高通量測序分析獲得的相對量，計算出土壤細菌總量、不同分類水平細菌的絕對含量，樣本一次測定即可同時獲得土壤細菌分類、相對丰度和絕對含量等信息（圖2-HAAQ）。
方法二[2]：針對有些實驗室獲取內標菌株困難或DNA樣品已通過高通量測序獲得了微生物分類及其相對丰度信息的實際情況，我們提出並驗證了iHAAQ（Integrated High-Throughput Absolute Abundance Quantification）方法獲得樣品細菌群落的絕對含量。其主要原理為：利用與高通量測序相同的引物對DNA樣品進行熒光定量PCR（qPCR），從而獲得樣品的細菌絕對總量，再與高通量測序所得的相對丰度相乘即可獲得不同分類水平細菌的絕對含量（圖2 iHAAQ）。
圖2 HAAQ與iHAAQ方法流程
3. 研究結果
將HAAQ和iHAAQ方法分別應用於土壤及其母質（紫砂岩）、疊氮化鈉抑菌劑處理土壤、菲污染土壤中細菌群落變化的研究，都發現了土壤細菌相對丰度和絕對含量變化趨勢相反的現象（圖3），絕對含量可比相對丰度更好地揭示跨樣本間微生物的變化（圖4）。同時，我們首次報道了土壤細菌在屬水平的濃度服從偏對數正態分布，絕大部分的細菌濃度為103.5~106.5個細胞/克干土（圖5）。基於本研究分析方法及測序深度等，測試樣本的土壤微生物「暗箱」中低於103個細胞/克干土（相對丰度約為萬分之一）的細菌仍難以被檢測。
圖3. HAAQ法揭示疊氮化鈉處理土壤的細菌群落變化
圖中，I表示細菌屬相對丰度增加而絕對含量降低；II和III分別表示細菌屬相對丰度和絕對含量同時降低或增加。
圖4 菲污染土壤修復中細菌群落相對丰度（A）和絕對含量（B）熱圖
圖中，0和28表示處理時間0天和28天；P表示添加菲處理組；S表示添加疊氮化鈉處理組；W表示添加Massilia sp.WG5處理組。
圖5 土壤屬水平細菌濃度分布情況
圖中S0和S14分別表示土壤添加疊氮化鈉後培養0天和14天。
4. 總結
通過HAAQ和iHAAQ法獲得的土壤細菌分類、相對丰度和絕對含量等信息，可更方便、更完全地揭示微生物群落及其變化，為進一步研究土壤微生物數量生態學提供了新的方法和支撐。
5. 參考文獻
[1] Yang L., Lou J., Wang H. Z., Wu L.S., Xu J. M., 2018. Use of an improved high-throughput absolute abundancequantification method to characterize soil bacterial community and dynamics.Science of the Total Environment 633, 360-671. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.03.201
[2] Lou J., Yang L., Wang H. Z., Wu L. S., Xu J. M., 2018. Assessing soil bacterial community and dynamics by integratedhigh-throughput absolute abundance quantification. PeerJ 6, e4514. https://doi.org/10.7717/peerj.4514
作者信息：
Q&A
1盧瑟菌：
土壤本底E.coli是否會影響結果？如何消除影響？
作者：
參考文獻中發表於Science of the Total Environment的那篇文章中有針對該問題進行討論。文章中有設置Control對照組，即添加等體積無菌水作為對照，同時進行高通量測序，因此可將本底E.coli扣減。與此同時，我們採用了兩個公式平行計算屬水平的絕對含量，其中公式之一，將Control中測得的E.coli扣減，另一公式中默認土壤本底E.coli為零。兩個公式分別計算出的絕對含量除了E.coli所在屬有顯著差異，其他屬的均無顯著差異。也即表明，在無糞肥添加的天然土壤中大腸桿菌自然丰度較低，即使忽略對計算結果影響也較小。
2盧瑟菌：
為何構建含GFP菌株後通過顯微鏡計數來對內標菌株進行定量，直接染色或通過測定OD值是否更簡單？
作者：
對於菌液中內標菌株的定量，直接染色或OD測定都可以。但在我們論文研究中，既要對添加到土壤前的菌液中菌體定量，也要對添加到土壤後的內標菌株進行定量。用染色法、OD值無法對土壤中內標菌株進行專一性定量，而用GFP標記後可對內標菌株和土著微生物進行區分。所以，為確保土壤中內標菌株的計數，我們研究中選用GFP標記。
有關土壤微生物定量為數不多的文獻中，對選用添加前還是添加後的內標定量並未見詳細報道。基於此，我們採用了三種方法同時對添加土壤前菌液中和添加土壤後HAAQ-GFP進行絕對定量：顯微鏡計數、平板計數和qPCR。GFP標記的優勢在於，它不僅能使菌體細胞熒游標記，方便熒光顯微鏡計數定量；同時，GFP質粒上還具有Amp抗生素基因，使得菌體具有氨苄青黴素的抗性，方便添加至土壤後還能提取出來用於平板（含氨苄青黴素）計數。根據三種方法的結果，我們發現一旦內標菌株被添加進土壤後，再提取出來都會存在較大的損失，所以最後得出結論是採用添加前顯微鏡計數結果，最為接近添加的真實值，也更能揭示出本底細菌的真實含量。
3盧瑟菌：
內標菌的GFP在死菌中應該不表達，因此計數時死菌會被忽略；但其16S rDNA往往仍會在後續高通量測序中被檢測到，即HAAQ方法是否會在對內標菌定量時，因只能區分活菌而可能低估其細胞數？
作者：
文章中，我們有對細菌液體培養中HAAQ-GFP同時進行平板計數和顯微鏡計數，假設如果存在不表達GFP的死菌，即檢測不到熒光且死亡不生長，那顯微鏡計數結果應當是等於平板計數結果的。而所得結果中，顯微鏡計數結果值>平板計數結果，這反而表明了細菌的活的不可培養的狀態（viablebut non-culturable states）。所以，問題中所假設的情況，在我們研究中存在的可能性較小。
之前也有閱讀過研究環境樣品中死菌DNA的報道，也有學者提出相應的解決手段，如果要考慮添加的內標菌中的死菌，也需等同考慮環境中的死菌DNA，那就又是另外一篇文章啦~
4盧瑟菌：
通過HAAQ-GFP方法進行絕對定量時，是否每個樣品都要設置對照組？這樣的話就不太適合大樣本量了。
作者：
如問題1回答中，天然土壤中E.coli丰度較低，可忽略不計，對計算結果沒有顯著影響。所以，大腸桿菌未污染的天然土壤使用HAAQ方法進行定量，不需要設置對照組。另外，為了使得內標法普適性更強，我們正在想辦法解決這個問題，敬請期待~
5盧瑟菌：
與公眾號以前發表的類似方法相比，有哪些優勢？（見公眾號歷史文章「內標法測序研究生物炭對大豆土壤細菌群落的影響」）
作者：
以前發表在公眾號的文章「內標法測序研究生物炭對大豆土壤細菌群落的影響」參引的是Smet et al. (Soil Biology & Biochemistry, 2016, 96, 145–151)方法，以Aliivibrio fischeri的DNA作為內標物質添加至土壤樣品中，再進行土壤DNA提取的步驟。有研究表明土壤對細胞和胞外DNA的吸附是不同的，從而土壤DNA提取步驟對本底細胞的提取和Aliivibrio fischeriDNA的再次提取效率可能是不同的，便影響了後續以此為基礎的估計準確性。我們HAAQ方法的內標是菌株細胞，更為接近土壤本底的細菌，從而使得提取效率更為接近。與此同時，我們在添加前便對內標菌株進行定量，將後續損失步驟包括在內，從而使得計算值更為接近本底真實值。另外，iHAAQ方法則是利用高通量測序的相同引物對DNA樣品進行qPCR測定分析獲得微生物總量，再與高通量測序結果中相對丰度相乘，即可獲得不同分類水平微生物的絕對含量。對已通過高通量測序獲得了微生物分類及其相對丰度信息的樣品，後續通過iHAAQ方法可補充獲得不同分類水平微生物的絕對含量。
6盧瑟菌：
E.coli及環境中絕大多數微生物的16S並非單拷貝，本文方法是否考慮該因素？16S多拷貝會對本文方法有何影響？
作者：
我們也考慮到了這個問題，所以論文中數據同步採用了RDP資料庫分析，對16S rRNA基因拷貝數進行一個校正，從而使得計算結果更為精準。詳細內容見參考文獻[1]原文。
7盧瑟菌：
請指明文中方法的適用範圍及有待完善之處。
作者：
兩種方法僅對細菌域進行了驗證，古菌域與真菌域微生物絕對定量有待進一步開發和驗證。
致謝
特別感謝國家海洋局第三海洋研究所黃兆斌博士對本文的細緻審閱及修改！
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