兩個小分子，助力構建人多能幹細胞精準基因編輯新技術體系！

2018年4月3日，浙江大學祝賽勇實驗室在Nature Communicaitons在線發表了題為「Small molecules promote CRISPR-Cpf1-mediated genome editing in human pluripotent stem cells」的研究論文，建立了對人多能幹細胞（hPSCs）進行更高效和精準基因編輯的技術體系。

背景

自從CRISPR-Cas9的發現以來，全世界的科學家們一直在努力改進或調整CRISPR-Cas9系統以便滿足他們各自的特定需要。人們開始嘗試使用小分子藥物提高基因編輯的效率和準確性。

2015年，小分子L755507與Brefeldin A被發現能夠促進基於CRISPR-Cas9的基因編輯效率【1】；不久後，有文章報道DNA連接酶IV的抑製劑SCR7也能夠有效促進CRISPR-Cas9基因編輯的效率【2,3】。

隨著CRISPR-Cas9日漸成熟，人們很難想像不使用CRISPR-Cas9的情形下如何進行基因編輯。而作為Cas9的一種潛在替代者---土拉熱弗朗西絲菌（Francisella novicida）的CRISPR結合蛋白Cpf1出現了，它表現有雙重切割活性：不僅切割DNA，而且也切割RNA。此外，它是人們迄今為止發現的最簡單的CRISPR免疫系統【4】。同時Cpf1的crRNA長度比Cas9短得多，脫靶率也更低【5】。

基於CRISPR-Cpf1的hPSCs精確基因組編輯

祝賽勇實驗室在本項研究里，開發了hPSC中的CRISPR-Cpf1介導的基因組編輯系統，證明了CRISPR-Cpf1可用於高效地產生敲除和敲入hPSC系。

ALKBH1和CLEC16A基因的敲除hPSCs系，

基於T7E1測定法觀察到20-30％Indel率

有趣的是，為了解決敲入效率較低的問題，研究人員將600種小分子加入到48孔板中的hPSC培養基中，電轉染OCT4-eGFP敲入系統，最終用嘌呤黴素選擇系統進行篩選。他們確定了可能增加嘌呤黴素抗性hPSC數量的多種小分子，其中VE-822和AZD-7762兩種最有效。而在沒有藥物選擇的情況下，這兩種小分子更能顯著促進CRISPR-Cpf1介導的敲入hPSC系的產生，並且作用是可以疊加的。

加入VE-822和AZD-7762增加了

OCT4-tdTomato陽性細胞的百分比

這兩種小分子VE-822（DNA損傷檢查點的關鍵激酶蛋白）和AZD-7762（一種有效的ATP競爭性的細胞周期檢測點激酶Chk的抑製劑）在點突變幹細胞株系構建和多重位點基因編輯等方面，也具有顯著的促進作用。因此，CRISPR-Cpf1基因編輯系統與小分子藥物的組合，可以實現對人多能幹細胞進行更加簡單、高效和精準的基因編輯，從而更好地應用於基礎生物學研究、疾病模型構建、藥物篩選和臨床轉化。

CRISPR-Cpf1與小分子藥物組合，實現對人多能幹細胞進行精準基因編輯，促進基礎研究和臨床轉化

參考文獻

Yu, C. et al. Small molecules enhance CRISPR genome editing in pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 16, 142–147 (2015).

Chu, V. T. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.Nat. Biotechnol. 33, 543–548 (2015).

Maruyama, T. et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat. Biotechnol. 33, 538–542 (2015).

I. Fonfara et al., 「The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA,」 Nature, doi:10.1038/nature17945, 2016.

Zetsche, B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 163, 759–771 (2015).

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