CRE防控需要打出組合拳！

編者按

近些年，產碳青黴烯酶的腸桿菌科細菌（CPE）的出現及傳播日益引起人們的關注，尤其是多粘菌素耐葯基因（MCR）的出現，為治療產碳青黴稀酶腸桿菌感染帶來了極大挑戰。本文分析評估了在葡萄牙某醫院CPE患者中分離到的CPE的mcr-1基因的攜帶情況，旨在引起有關專業部門和專業人士的關注，共同採取行動遏制mcr的傳播。

來自葡萄牙某醫院住院患者產碳青黴烯酶

肺炎克雷伯桿菌耐葯基因分析

檢索：廖丹

翻譯：余海洋

審校：李雷雷 周艷芝

摘要

我們描述了一起發生在葡萄牙，由一種產碳青黴烯酶3（CPE）的mcr-1陽性且基因序列45型的多重耐葯肺炎克雷伯菌引起的醫院感染暴發事件。 mcr-1位於IncX4質粒中。 我們的數據強調了對mcr-1基因進行系統監測的迫切需要，來幫助醫院選擇適當的治療方案。

自2011年以來，歐洲若干國家的住院患者感染產碳青黴烯酶的腸桿菌科細菌（CPE），如肺炎克雷伯菌，且感染率一直在增長，尤其是那些耐葯率高的細菌。多粘菌素耐葯基因（MCR）的出現尤為引人注意，因為多粘菌素被廣泛用作治療產碳青黴稀酶腸桿菌的最後可選擇的藥物。在歐洲，已有散發的攜帶mcr-1基因的臨床CPE分離株的報道。 由於CPE在葡萄牙以驚人的速度增加，我們評估了在葡萄牙波爾圖中心醫院（一所三級大學附屬醫院）入院的CPE患者中分離到CPE的mcr-1基因的攜帶情況。

研究

標本來自2015年10月至2017年7月期間，5,361名入住波爾圖中心醫院的患者的直腸拭子標本，我們使用Brilliance CRE Agar（Brilliance 耐碳青黴烯腸桿菌瓊脂）、Blue-carba 試驗篩選碳青黴烯酶陽性分離株並通過實時PCR篩查碳青黴烯酶基因（Xpert Carba-R; Cepheid, Sunnyvale, CA, USA）（圖1，A圖）。我們共篩查出283名患者，359份CPE陽性標本，開展進一步檢測。 在359株分離株中，252株（75％肺炎克雷伯菌陽性）來自患者的糞便樣本，107株（86％肺炎克雷伯菌陽性）來自患者的其他樣本（例如血液，尿液）。 然後，我們採用PCR和基因測序方法（5,8,9）從這些分離株中篩查mcr-1，blaCTX-M-I樣基因和blaKPC。 我們參照臨床和實驗室標準研究所/歐洲抗菌藥物敏感性委員會測試指南檢測mcr-1基因陽性分離株的藥物敏感譜，用肉湯微量稀釋法測定陽性菌株對多粘菌素的抗菌藥物敏感性，通過紙片擴散法測定對其他藥物的敏感性。我們通過多位點序列分型和wzi莢膜分型評估肺炎克雷伯菌菌株間的克隆相關性，並使用PCR評估質粒複製子含量。我們通過Hi Seq 2500測序系統（Illumina Inc.，San Diego，CA，USA）（2×150bp配對讀數，覆蓋率100×）對分離出的2株肺炎克雷伯菌克隆株進行全基因組測序。採用SPAdes版本3.9.0重新組合閱讀並且使用Prokka註明重疊群。我們使用來自基因流行病學中心的工具來評估耐抗菌藥物基因和複製子，並且用PLACNETw進行質粒重建。我們通過PCR和基因測序（圖2）在靠近複製（pirF）和維持（parA）保守區的IncX4質粒中定位到mcr-1。

我們從2016年9月至2017年2月收集的16例住院患者樣本中鑒定出24株產CPE併產MCR-1的肺炎克雷伯菌（圖1，B圖）。17個分離菌株為定植（即患者的胃腸道細菌），7個來自身體其他部位（3個尿液，2個血液，2個其他體液）（表）。每名患者平均分離到1-4株細菌; 分離的10株定植株均來自重症監護病房。患者（9男7女）年齡範圍為50-87歲，其臨床病史包括住院時間延長（平均47 d，範圍12-151 d）；併發症；並且他們中許多都有手術史，免疫抑制，或先前抗菌藥物使用史（常為B內醯胺類），這些都有利於多重耐葯（MDR）mcr-1陽性菌株的感染或定植。患者入院時（14/16篩查的患者中）或入院後的平均15天內（範圍3-94）糞便樣本為CPE陰性（圖1，B組）。 5位患者有1-2次腸外感染時分離出攜帶MCR-1基因的菌株，有時，分離出先前在其胃腸道中檢測到的相同菌株。

患者在檢出mcr-1前，並未記錄其多患者粘菌素使用和旅行史，但16名患者中的5名在過去的6個月中已經住過院。這些患者均按照臨床標準開展了CPE感染治療，治療方案為多粘菌素加一種碳青黴烯類抗菌素，輔以磷黴素，替加環素或哌拉西林/他唑巴坦。起初，我們使用了傳統的抗菌藥物敏感性試驗VITEK 2（bioMérieux，Marcy l"Etoile，France）和Etest（bioMérieux）檢測多粘菌素耐藥性，但由於其結果不可靠，所以我們漏掉了粘菌素耐藥性。2017年7月，多粘菌素耐藥性監測和CPE菌株的mcr-1篩查才得以開展。

攜帶mcr-1.1基因的分離株對多粘菌素耐葯（MIC 4-8mg / L），產生肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶3（KPC-3），而且大多數（79％）產生CTX-M-15 B內醯胺酶。除了對第三代、第四代頭孢菌素和單醯胺類抗菌素耐葯（100％）外，分離到的肺炎克雷伯菌菌株也常常對萘啶酸（100%），環丙沙星（96％），替加環素（96％），四環素（92％），妥布黴素（88％ ％），慶大黴素（88％），磷黴素（83％），甲氧苄啶/磺胺甲惡唑（79％）和氯黴素（67％）耐葯（見表）。所有分離株都對阿米卡星（腎功能不全患者禁用）和頭孢他啶/ 阿維巴坦酶抑製劑（未上市）敏感。

除1株肺炎克雷伯菌外，其餘所有菌株都屬於序列類型（ST）45，並攜帶wzi101 / K24，這株克隆株在葡萄牙臨床多重耐葯肺炎克雷伯菌分離株中很少發現 [5,6]，但已在同一時期產KPC-3菌（不攜帶mcr-1基因）中循環（L. Peixe，unpub.data）。我們從一名患者的腹壁膿腫的膿液中檢測到1 mcr-1陽性的肺炎克雷伯菌（莢膜型KL122）ST1112的分離株（表），該患者先前收集的糞便和尿液樣本中分離出攜帶mcr-1陽性ST45基因的菌株。這2株全基因組測序出的攜帶ST45基因的肺炎克雷伯菌分離株具有對氨基糖苷類[aac（6"）Ib-cr，aac（3）-IIa]，B內醯胺類（blaKPC-3，blaSHV-1，blaOXA-1），氟喹諾酮類[qnrB66，aac（6"）Ib-cr，oqxAB]和其他抗菌藥物[catB4，tet（A）]耐葯的基因編碼；這2株分離株中的其中1株具有另外的基因aph（4）-Ib，strAB，blaTEM-1B，blaCTX-M-15，catA1，sul2和dfrA14。

所有mcr-1基因陽性分離株中，基因位於IncX4型質粒中（圖2）。比較基因組學顯示，該質粒（pAN_M1A）在許多不同國家（包括葡萄牙）的多種不同宿主（人類，豬，家禽）和環境中循環。我們從之前調查中的一個≈58-kb IncN-ST15質粒的Tn4401d亞型中確定了blaKPC-3 基因；blaCTX-M-15基因與多複製子質粒IncFIIK-FIA-FIB相關。

我們發現，5.7％（16/283）的住院患者的胃腸道定植有mcr-1陽性CPE，而這些患者中有1.8％（5/283）發生了感染；這與中國的相關報道相似（糞便定植率高達6.2%，感染率為1%）。在中國，僅報道過1次攜帶mcr-1的臨床分離株的暴發[13]，而在歐洲，其發生率低（

考慮到入院時沒有檢出CPE，但有可能是醫院獲得和攜帶mcr-1的產KPC-3菌株院內播散所致; 然而，我們不能排除也可能來自其他肺炎克雷伯氏菌譜系或大腸桿菌。雖然在葡萄牙由mcr-1陽性菌株引起人的細菌定植率尚不清楚，但曾經在家畜中檢測到mcr-1（如在豬中檢出肺炎克雷伯菌ST45），提示產MCR-1的腸桿菌可通過食物鏈傳播，且在其他腸桿菌科中廣泛播散（8,11,14,15）。

結論

我們從一起與暴發相關聯的產碳青黴烯酶-3的多重耐葯的肺炎克雷伯菌發現了MCR-1基因。CPE高發生率和多粘菌素的高使用率（2,5,6），以及MCR基因的社區傳播，提示在未來還會有類似事件的發生。我們的研究結果強調，要讓不同專業人員和醫療機構採取協調一致的行動，來監測並遏制mcr通過人和動物，食物鏈和環境的播散。

圖1 A

圖1 2016-2017葡萄牙mcr-1陽性產碳青黴烯酶3腸桿菌感染患者的篩選和檢測。 A）流程圖顯示樣本選擇的基本原理。首先，我們通過用Brilliance CRE瓊脂（Oxoid，Basingstoke，UK）；Xpert Carba-R（Cepheid，Sunnyvale，CA，USA）;和VITEK 2（bioMérieux, Marcy l』Etoile, France）檢測患者糞便樣品，篩選胃腸道中CPE的無癥狀攜帶（即CPE定植）;其次，我們測試了所有患者已有樣本的CPE。最後，我們對篩選出碳青黴烯酶的分離株進行mcr-1基因檢測，以對最後的樣本進行鑒定樣本。*約75%患者具有CPE分離株和完整的流行病學和臨床數據。?用於篩選mcr-1的最終樣品僅包括非重複分離株。對於糞便樣本而言，我們認為72小時內採集的，從同一名患者的多份樣本中檢測到的分離株為重複菌株；對其他類型樣本而言，認為從同一時間點採集的同一類型樣本中檢測到分離株為重複菌株。?從胃腸道或身體其他部位分離到攜帶mcr-1陽性基因的4名患者。 B）代表16名mcr-1陽性CPE患者流行病學數據的時間軸。 CPE，產碳青黴烯酶的腸桿菌科; ICU，重症監護室; MED，醫療單位; SURG，外科病區;TU，移植病區。

圖2

圖2 不同來源和不同地區含有mcr-1的 IncX4代表性質粒比對圖。含有mcr-1的 pAN_M1A質粒作為參考質粒。最外面的圓圈是參考質粒的基因注釋，並顯示開放閱讀框的轉錄方向。灰色代表Pil基因位點和其它基因，深藍色代表相關基因複製，紅色代表耐葯基因，綠色代表插入序列。用紅色箭頭指示攜帶mcr-1的質粒的PCR定位策略。引物P1對應pirF，P2對應 mcr-1（3.3kb），P3 對應mcr-1和P4對應 parA（2.1kb）

表：2016-2017年葡萄牙分離到產KPC-3和MCR-1的肺炎克雷伯菌的16名患者的人口統計學和流行病學數據

CAM，氯黴素; CIP，環丙沙星; FOT，磷黴素; GEN，慶大黴素; ICU，重症監護室; KAN，卡那黴素; KPC-3，肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶3; MCR-1，調動了粘菌素抗性1; MED，醫療病區; MIN，米諾環素; MLST，多位點序列類型; NAL，萘啶酮酸; 奈替米星; SURG，外科病區; ST，序列類型; STR，鏈黴素; SXT，甲氧苄啶/磺胺甲惡唑; TET，四環素; TGC，替加環素; TOB，妥布黴素; TMP，甲氧苄啶;TU，移植病區。

文獻來源：

Mendes A, Novais ?, Campos J, Rodrigues C, Santos C, Antunes P, et al. mcr-1 in Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae with Hospitalized Patients, Portugal, 2016–2017. Emerg Infect Dis. 2018;24(4):762-766.

圖文編輯：小小

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