NCB：一種新的m6A閱讀器！可促進mRNA翻譯和穩定性
m6A是在真核細胞mRNA中最普遍存在的修飾，需由閱讀器 (reader) 識別 (比如YTH結構域蛋白)，調控mRNA的命運。近日，中山大學楊建華教授團隊、辛辛那提大學陳建軍教授以及芝加哥大學何川教授團隊等合作，發現IGF2BP蛋白 (胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白) 是一種獨特的m6A閱讀器，它不像YTH結構域家族蛋白那樣促進mRNA降解，而是使mRNA更穩定！咱們來看看他們是如何發現這種新reader的：
發現IGF2BP是m6A結合蛋白
研究者通過兩個方法，篩選m6A結合蛋白：1. 使用甲基化的單鏈RNA誘餌 (ss-m6A，共有序列為GG(m6A)CU)，對照組為未甲基化的RNA (ss-A)，進行RNA pull-down和質譜分析；2. 利用自主研發的一個新計算流程：基於已發表的RBP CLIP-seq (紫外交聯免疫共沉澱測序) 資料庫和已知的m6A修飾位點，篩選出潛在m6A結合蛋白。
a.質譜分析表明3種IGF2BP蛋白與ss-m6A結合。b.計算結果表明這3種IGF2BP在112個顯著的RBP裡面排前15。c. FLAG-IGF2BP上富集有m6A修飾。d. 對比RIP-seq結果和已發表的PAR-CLIP數據，找到3種IGF2BP蛋白的高可信度靶基因。
通過這種方法，研究者鑒定得IGF2BP為m6A結合蛋白。
發現IGF2BP能使靶基因更穩定
為探究IGF2BP的作用，研究者進行了功能缺失實驗，即敲降IGF2BP，進行RNA-seq，發現靶基因的表達因此減少：
CLIP組靶基因 (CLIP數據所示的靶基因) 表達被抑制，特別是CLIP+RIP組靶基因 (RIP-seq與CLIP數據重疊的靶基因)。
IGF2BP的這個功能否受胞內m6A水平影響呢？降低m6A水平，常用的方法是敲降甲基轉移酶METTL3或METTL14；研究者敲降HepG2細胞的METTL14後，進行m6A-seq和RNA-seq，發現有1,516個基因的m6A修飾相應減少，其中有418個基因的mRNA水平下降，而IGF2BP的高可信靶基因都在此列，下調顯著。IGF2BP和METTL14的關聯表明IGF2BP與m6A調控的基因相關。
d. HepG2細胞敲降METTL14後的m6A水平與基因表達水平，兩者均下降的418個基因即為m6A-Hypo-down組；e. shMETTL14細胞中IGF2BP高可信靶基因的mRNA log2 FC累積頻數；f.METTL3或METTL14沉默後FSCN1、TK1、MARCKSL1和MYCmRNA水平。
研究者敲降了細胞的IGF2BP3，檢測mRNA穩定性，發現IGF2BP3和CLIP的高可信度靶基因的中位半衰期都顯著縮短了將近一半！
還有哪些因子共同增強mRNA的穩定性呢？研究者對IGF2BP2複合物進行了pull down與質譜分析，發現存在著ELAVL1 (也叫HuR)，MATR3和PABPC1，這3個都是已知的mRNA穩定劑（mRNA stabilizers）。以上結果表明IGF2BP2有助於其靶基因穩定翻譯。
發現m6A對IGF2BP的作用
MYC是IGF2BP1的靶基因，研究者發現m6A修飾在MYC上積累，且m6A的峰與IFG2BP結合位點一致；CRD區 (不穩定編碼區) 的m6A修飾丰度很高，且在METTL14敲降後顯著減少；通過RIP和基因特異m6A實驗，研究者證明CRD區域內存在IGF2BP結合、m6A修飾、METTL3和METTL13的結合：
a, m6A-seq和RIP-seq所得的MYCmRNA與m6A峰的分布圖 ；b, RIP–qPCR顯示MYC CRD中的FLAG-tagged IGF2BPs；c, gene-specific m6A qPCR實驗檢測MYCCRD的m6A修飾 ；d, RIP–qPCR 顯示METTL3和METTL14 結合到m6A CRD. e, RNA pull down，分別用有m6A或者沒有m6A修飾 (即圖中「A」實驗組)的CRD1、CRD2來拉IGF2BP。
接下來，研究者利用熒光素酶報告實驗，檢測突變CRD序列之後IGF2BP的表達情況；聯合RIP-qPCR實驗，證明CRD的m6A修飾對IGF2BP結合到MYC以及調節MYC表達是必需的。研究者還發現KH3-4雙結構域對IGF2BP與帶m6A修飾的mRNA的結合，以及調控靶基因有著重要的作用。
驗證IGF2BP的致癌作用
Cancer Genomics cBioPortal與TCGA的數據顯示，3種IGF2BP在多種腫瘤中均有異常高表達，聯繫本研究中它們對致癌基因如MYC的穩定作用，研究者推測IGF2BP具有致癌作用，於是他敲降了HeLa和HepG2細胞的IGF2BP，結果抑制了這些腫瘤細胞的增殖、克隆形成能力和細胞遷移/侵襲，效果如同沉默MYC；利用CRISPR-Cas9技術敲除IGF2BP，再添加KH3-4突變的IGF2BP進行挽救實驗，證明IGG2BP的致癌功能依賴於KH3-4，即m6A reader。
Epi老師：值得一提的是，NCB雜誌同期還配發了題為「An additional class ofm6Areaders」的評述文章，對該工作給予了高度評價。這項研究鑒定得新的m6A識別蛋白家族IGF2BP1/2/3，並且發現它有著與已知的YTH結構域蛋白有著截然不同的功能，拓寬了我們對m6A識別蛋白的機制和功能的認識。Epi老師相信這個新發現會讓m6A研究進一步升溫！
圖為3類m6A識別(reader)蛋白。a, 第一類，YTH結構域(藍色顯示)蛋白，與m6A(紅色顯示)直接結合。b, 第二類，利用m6A開關機制與含m6A的轉錄本結合：RNA的m6A修飾會破壞鹼基互補配對，提高單鏈RNA基序的可進入性，從而被m6A識別蛋白識別(綠色顯示)。RNA基序可以與m6A位點重疊。這類識別蛋白有hnRNPC、hnRNPG，hnRNPA2B1也可能屬於這類蛋白。c, 此研究新發現的一類識別蛋白，利用共有的RNA結合結構域(RBD)及其側翼區(綠色顯示)來識別含m6A的轉錄本。這類識別蛋白包括IGF2BP，利用KH結構域及側翼區來選擇性結合含m6A的RNA；hnRNPA2B1也有可能屬於這類蛋白，它的RRM及側翼區可能有助於m6A選擇。
原文: Huang H,et al. Recognition of RNA N6-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation.Nat Cell Biol. 2018 Mar;20(3):285-295.PMID: 29476152
楊建華教授個人簡介
楊建華教授，中山大學博士生導師，長期致力於開發新演算法、平台和實驗方法研究非編碼RNA基因和RNA修飾及其互作蛋白的結構、功能和作用機制。以通訊作者或第一作者身份在Nature Cell Biology、Cell Research、Nucleic Acids Res.、Cell Reports等雜誌發表20多篇研究論文，以合作者身份在Nature Methods、Cell Stem Cell等雜誌發表10多篇研究論文。開發starBase、starScan、snoSeeker和ChIPBase等工具被Nature等雜誌引用超過1200次，受邀在Springer出版社出版了3篇關於非編碼RNA研究方法的論著章節。目前擔任Non-coding RNA雜誌的編委。
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