重大進展：環形RNA參與造血幹細胞靜息狀態調控
4月3日，知名免疫學雜誌Immunity在線發表了中科院生物物理所范祖森教授與王碩研究員為共同通訊作者的文章，介紹發現環形RNA Cia-cGAS（作者自己命名）定位於細胞核中，可結合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS並抑制其活性，調控長效造血幹細胞（LT-HSC）靜息狀態[1]。
介紹本文的內容之前需要補充幾個背景知識點：
長效造血幹細胞（Long-term Hematopoietic stem cells，LT-HSC）：一種能持續自我更新和分化為下游造血細胞的幹細胞，處於造血系統分化譜系（Lineage）的上游。
短效造血幹細胞（short-term Hematopoietic stem cells，ST-HSC）：在造血分化譜系中位於LT-HSC下游，自我更新能力弱於LT-HSC。
多潛能幹細胞（multipotent progenitors，MPP）：在造血分化譜系中位於LT-HSC下游，具有繼續分化為淋巴系和髓系前體細胞的潛能，但失去自我更新能力。
cGAMP合酶（Cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthasce，cGAS）：通常位於胞質中，當結合DNA後催化生成cGAMP，後者與干擾素刺激因子（Stimulator of Interferon Genes，STING）結合，促進I型干擾素（IFN）的表達。
本文作者首先基於高通量測序比較了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全轉錄組變化情況，這其中共發現了156種存在明顯表達差異的circRNA分子，其中49種在LT-HSC中表現為上調。進一步的表達驗證中發現有9種circRNA分子在LT-HSC中存在明顯的上調。然後通過shRNA實驗分析功能，發現其中只有來自D430042O09Rik的circRNA Cia-cGAS干擾後明顯改變造血幹細胞的亞群分布，因此鎖定研究目標為Cia-cGAS分子。作者進一步驗證了只有干擾Cia-cGAS才能有明顯的效應，而單獨干擾D430042O09Rik並無明顯表型。然後基於迷你基因載驗證，證明Cia-cGAS序列下游的反向互補序列是促進其生成的關鍵，於是作者通過Cas-9基因敲除策略成功構建了Cia-cGAS基因敲除小鼠。在Cia-cGAS基因敲除小鼠中作者發現LT-HSC明顯減少，I型干擾素表達升高。通過RNA Pull-down實驗，作者鑒定到Cia-cGAS可以與cGAS結合，又通過RIP，RNA Pull-down，FISH共定位以及EMSA等實驗驗證了這一相互作用，進一步，作者還通過預測分析結合突變實驗分析了Cia-cGAS與cGAS相互作用的位點信息。酶學功能研究證明，Cia-cGAS與cGAS相互作用能夠抑制cGAS的活性。
本文的故事非常嚴謹，邏輯清晰，為circRNA的功能研究提供了非常好的參考範本。下面就讓我們一起學習一下作者如何一步步探究Cia-cGAS的功能和機制的：
作者如何找到Cia-cGAS的，為什麼要研究其在造血幹細胞中的功能？
為探索造血幹細胞功能相關的circRNA分子，作者比較了小鼠的各種造血幹細胞中全轉錄組的變化情況，找出了156種存在明顯表達差異的circRNA分子，其中49種在LT-HSC中表現為上調。RNase R消化後QPCR分析其中有9種驗證為明確在LT-HSC中表達上調的circRNA。
圖1 測序篩選HSC相關circRNA分子 （來自[1]）
為有效篩選到與造血幹細胞功能有關的circRNA分子，作者體外感染對應circRNA的shRNA病毒，然後移植回小鼠體內（提前用射線照射殺死內源細胞），如果所對應的circRNA會明顯影響造血幹細胞的功能，在造血幹細胞的亞群分布中便能得到體現，結果表明只有干擾Cia-cGAS後才能明顯影響造血幹細胞的亞群分布，表現為LSK祖細胞的明顯增高，與此同時LT-HSC明顯減少。因此，作者將研究對象鎖定在Cia-cGAS分子。
圖2 干擾circRNA後對HSC亞群的影響分析 （來自[1]）
與此同時，作者也進一步分析了Cia-cGAS的組織表達，進化保守性，亞細胞定位等基本信息。
圖3 Cia-cGAS的組織表達和進化保守性分析 （來自 [1]）
Cia-cGAS來源於D430042O09Rik基因，那麼上述的表型會不會是線性RNA的作用呢？作者分析後表明所使用的shRNA並不對線性RNA起作用，有趣的是線性的D430042O09Rik 產物RNA位於胞質中而Cia-cGAS主要位於細胞核內。進一步，專門針對線性D430042O09Rik的干擾RNA並不影響造血系統的亞群分布，但同時針對線性和環形RNA的干擾RNA則能明顯影響造血幹細胞亞群分布。
圖4 僅有Cia-cGAS干擾後才影響HSC亞群分布 （來自[1]）
Cia-cGAS敲除小鼠怎樣構建的？敲除模型中的表型如何？
通過上述的實驗，環形RNA Cia-cGAS是影響造血幹細胞功能的關鍵，線性的D430042O09Rik基因RNA沒有這一功能，因此如何構建特異性敲除Cia-cGAS是進一步探索其功能的關鍵。首先我們來認識一下Cia-cGAS和對應的母基因D430042O09Rik的關係，以及作者構建敲除Cia-cGAS的設計思路：
Cia-cGAS是由其母基因D430042O09Rik的4~6號外顯子環化形成的，作者的敲除策略是刪除下游內含子中反向互補序列相關的片段。
圖5 Cia-cGAS敲除方案設計 （來自[1]）
在構建基因敲除的小鼠之前，作者首先針對D430042O09Rik基因對應的內含子序列設計了迷你基因系統，分析與Cia-cGAS生成相關的內含子序列片段，結果證明在外顯子4上游和外顯子6下游的內含子中存在的反向互補序列是形成Cia-cGAS的關鍵，刪除下游的反向互補序列能夠實現特異性敲除Cia-cGAS。
圖6 迷你基因驗證與Cia-cGAS生成有關的反向互補序列 （來自[1]）
獲得敲除Cia-cGAS的小鼠模型後，作者分析了造血幹細胞的亞群分布等基本特徵，結果表明敲除小鼠中LSK細胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，這些小鼠出生6個月左右便死於貧血。Cia-cGAS敲除小鼠的LT-HSC的BrdU染色陽性率明顯高於對照組，說明敲除小鼠中LT-HSC細胞處於活躍的增殖分裂活動。作者還通過脈衝標記H2B-GFP的小鼠模型分析了敲除小鼠中LT-HSC處於靜息或活化狀態的比例，結果也顯示Cia-cGAS敲除後LT-HSC細胞處於明顯的活躍狀態，靜息狀態的比例顯著降低。
圖7 Cia-cGAS敲除後LT-HSC細胞靜息狀態減少 （來自[1]）
作者還發現敲除Cia-cGAS後I型干擾素的分泌增高。
圖8 敲除Cia-cGAS後I型干擾素的分泌增高 （來自[1]）
如何篩選和鑒定Cia-cGAS的相互作用分子？
敲除Cia-cGAS模型的表型非常明顯，那麼Cia-cGAS是如何發揮功能的呢？與Cia-cGAS相互作用的分子篩選和鑒定是研究其功能的關鍵。作者的策略是首先通過RNA Pull-down初步篩選出互作分子，然後進一步驗證。
circRNA的RNA Pull-down是非常有挑戰性的實驗，目前報道的數量還不多。作者的做法是先通過表達線性的Cia-cGAS進行初篩，然後進一步基於RIP和環形RNA的 RNA Pull-down驗證，進一步通過突變分析相互作用的相關序列信息。
將circRNA的序列線性化表達，反義鏈作為對照，釣取的蛋白跑膠後銀染，然後找出變化明顯的條帶質譜鑒定。通過這種方法，作者找到了cGAS蛋白。進一步通過抗cGAS抗體的RIP實驗證明了cGAS與Cia-cGAS的確有相互作用。免疫熒光+FISH實驗，進一步驗證了這一相互作用。基於電泳遷移率改變實驗（EMSA），作者通過構建Cia-cGAS的突變體，分析了相互作用的位點和片段信息。
圖9 篩選和鑒定Cia-cGAS的相互作用分子 （來自[1]）
酶學實驗證明Cia-cGAS結合cGAS能抑制cGAS的功能。
圖10 Cia-cGAS結合cGAS抑制cGAS的功能 （來自[1]）
此外，作者還進一步分析了Cia-cGAS結合併抑制cGAS的功能在小鼠HSC細胞乾性維持，LT-HSC靜息狀態調控以及相關免疫機能調控中的作用，因為這方面的內容對circRNA功能研究的參考意義有限，感興趣的讀者可進一步查看原文，在此從略。
本文的主要結論
至此，本文得出了如下結論：LT-HSC中Cia-cGAS結合併抑制cGAS的活性，Cia-cGAS敲除可導致LT-HSC中I型IFN升高。 Cia-cGAS可以保護靜息狀態的LT-HSC免受因cGAS持續活化而導致的細胞資源耗竭。Cia-cGAS是cGAS介導的識別和自身免疫應答的有效抑製劑。
圖11 Cia-cGAS主要功能模式圖 （來自[1]）
本文通過高通量測序篩選與造血幹細胞乾性維持相關的關鍵circRNA分子，進一步經過RNA干擾驗證了相關功能並鎖定待研究的目標分子，通過敲除內含子反向互補序列的策略構建了circRNA的敲除小鼠模型，驗證了Cia-cGAS在造血幹細胞中的功能。基於RNA Pull-down篩選可能與Cia-cGAS相互作用的蛋白並進一步通過RIP，RNA Pull-down，FISH共定位及EMSA實驗驗證了相互作用並分析了相互作用相關的具體信息。思路清晰，邏輯嚴謹。為circRNA的功能研究提供了非常有價值的範本，值得各位同行好好學習。
參考文獻：
1. Pengyan Xia, S.W., Buqing Ye, Ying Du, Chong Li, Zhen Xiong, Yuan Qu and Zusen Fan, A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity, 2018.
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