《細胞》子刊：準確預測CAR-T療效，康奈爾大學劉東方教授課題組成功開發了新方法｜奇點猛科技

2017年，無疑是CAR-T大放異彩的一年，諾華的Kymriah和Kite的Yescarta憑藉著良好的治療效果，相繼獲批進入臨床。

然而，作為一項新興生物技術，CAR-T也面臨著許多問題。其中，非常關鍵的一個問題就是，如何預測一種CAR-T對於某個特定患者的療效。畢竟，這些已經進入臨床的CAR-T並不是百分之百有效；同時，未來隨著許多不同類型的CAR-T相繼進入臨床，醫生也很有必要為患者挑選一款最合適的產品。

近日，來自美國康奈爾大學醫學院附屬醫院Houston Methodist研究中心微生物學與免疫學系的華人學者劉東方教授帶領的研究團隊，開發了一套全新的方案，通過量化免疫突觸的質量，來預測CAR-T的療效，並且證明了這一方案是準確可行的。這一發現發表在細胞子刊《分子治療》雜誌上[1]。

劉東方教授

為了更好的理解這一研究，我們需要簡單了解一下目前常規的CAR-T檢測項目以及CAR-T和免疫突觸之間的關係。

目前，美國FDA發布的臨床研究CAR-T比較常用的臨床檢測項目主要包括，CAR轉染陽性率以及CAR 基因拷貝數，IFN-γ釋放，CD4/CD8的比例。這是在臨床上進行CAR-T 治療前必須檢測的項目。 然而，這些檢測項目並不能對CAR-T的療效進行預測。

而在臨床前基礎研究中，大多是通過分子生化等常規經典手段（如細胞因子釋放測定，細胞毒性殺傷試驗等），體外細胞模型以及體內動物模型檢測對CAR-T療效進行評估預測[2]。這類方法不僅耗時耗力，而且重複性也很差，常常不同實驗室會出現不一致的結果。

因此，在基礎和臨床科研中，我們迫切需要新的預測CAR-T療效的策略與方法。

為此，劉教授及其科研團隊想到了免疫突觸。

免疫突觸 (Immunological Synapse, IS)是T細胞與靶細胞表面分子之間通過受體－配體相互作用得以緊密接觸，形成了一個重要行使T細胞免疫學功能的精密結構。這一結構貫穿了整個T細胞的抗原識別，充分活化，以及下游激活事件[3]。也就是說，免疫突觸對免疫反應的形成至關重要。

同時，在前期研究中，劉教授證實，CAR-T作為一類經過基因修飾賦予免疫細胞特異性抗原受體的T細胞群體，能夠有效地與腫瘤抗原結合，並形成功能性免疫突觸。同時，他還發現，不同的CAR-T 細胞與其相關的腫瘤細胞形成的特異性免疫突觸是不同的，它們的質量並不一樣。[4,5]

因此， 劉教授推測，CAR-T的免疫突觸的質量或可作為一種手段來預測CAR-T的治療效果。

CAR修飾的免疫細胞（藍色）通過免疫突觸與癌細胞接觸（黃色）

為此，劉教授首先開發了兩種互補的成像工具，一個是脂質雙分子層（lipid bilayer）免疫熒光顯微技術，另一個是垂直細胞配對系統（vertical cell pairing，VCP)。前者可以幫助人們觀測到CAR-T細胞形成的免疫突觸的完整結構，並對免疫突觸的四個指標，F-肌動蛋白在免疫突觸的熒光強度，腫瘤抗原的聚集，T細胞裂解顆粒（lytic granules, LGs）的極化以及重要下游信號分子的平均熒光強度進行量化。

而後者，可以清晰的觀察到CAR-T細胞與靶細胞之間形成的免疫突觸，同時，這一系統可以一次檢測3000個免疫突觸，顯著提高了負載效率。

隨後，劉教授便選擇了人們常用的兩種CAR-T(CD19-CAR 和 kappa-CAR)，以及針對這兩種CAR-T分別設計的包含不同共刺激因子的CAR-T（4-1BB-CAR T和CD28-CAR T）進行分析。結果發現，4-1BB-CAR T形成的免疫突觸無論是在F-肌動蛋白的熒光強度，腫瘤抗原的聚集程度還是腫瘤裂解顆粒的極化比例上，都要優於CD28-CAR T。也就是說，4-1BB-CAR T的免疫突觸質量優於CD28-CAR T。

而此前的研究表明，T細胞的免疫功能依賴於免疫突觸的質量[6]。因此，劉教授認為，4-1BB-CAR T對腫瘤細胞的殺傷力優於CD28-CAR T。

為此，劉教授首先採用了臨床上檢測CAR-T療效的黃金標準，4小時鉻51 釋放實驗以及細胞因子分泌對兩種不同類型的CAR-T進行分析。結果發現，無論是常規的4小時鉻51 釋放實驗還是細胞因子分泌方法，都顯示這兩種CAR-T的抗腫瘤活性沒有顯著性區別。也就是說，臨床常規檢測方法並不能準確預測CAR-T療效。

然而，當劉教授通過長期殺傷實驗來評估這兩種CAR-T的有效性和持續性時卻發現，對於同一種癌細胞來說，4-1BB-CAR T對癌細胞的殺傷力更大，可以更迅速的消滅癌細胞。同時，通過長期殺傷性實驗數據分析發現，4-1BB-CAR T的增殖能力相比於CD28 CAR-T更強。也就是說，事實上，相比於CD28 CAR-T，4-1BB-CAR T的體外抗癌活性更強。

4-1BB CAR-T的殺傷性（左圖）和增值能力（右圖）明顯優於CD28 CAR-T

隨後，劉教授還通過對其他不同類型的CAR-T的免疫突觸質量和抗癌活性進行了相關性分析，進一步證明了，免疫突觸的質量可以有效預測CAR-T的殺傷活性以及增殖能力。

最後，劉教授還分別在淋巴瘤和實體瘤小鼠模型中證明了，免疫突觸質量與CAR修飾的免疫細胞對癌細胞的殺傷力成正相關。即免疫突觸質量越高，對癌細胞的殺傷力也越強。顯然，這也為癌症的精準醫療提供了一個有利的方法。

下一步，劉教授還將通過驗證已上市或者已經正在進行臨床試驗的CAR-T類產品，進行免疫突觸功能測定試驗，推進臨床試驗。

參考資料：

1.Xiong W, Chen Y, Kang X, et al. Immunological Synapse Predicts Effectiveness of Chimeric Antigen Receptor Cells[J]. Molecular Therapy, 2018, 26(4).

2.Vera J F, Brenner M K, Dotti G. Immunotherapy of human cancers using gene modified T lymphocytes[J]. Current gene therapy, 2009, 9(5): 396-408.

3.Fooksman D R, Vardhana S, Vasiliver-Shamis G, et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation[J]. Annual review of immunology, 2009, 28: 79-105.

4.Zheng P, Bertolet G, Chen Y, et al. Super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer[J]. Journal of visualized experiments: JoVE, 2015 (96).

5.Bertolet G, Liu D. The planar lipid bilayer system serves as a reductionist approach for studying NK cell immunological synapses and their functions[J]. Natural Killer Cells: Methods and Protocols, 2016: 151-165.

6.Dustin M L, Chakraborty A K, Shaw A S. Understanding the structure and function of the immunological synapse[J]. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 2010, 2(10): a002311.

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