豈知毒性蘊，一物本多姿：polyQ蛋白構象多態性與細胞毒性

撰文 | Sherry Feng

引導語

在人體千千萬萬的細胞中，林林總總的蛋白像小人兒一樣時時刻刻發揮著作用。在這些小人中，有一群小人兒（polyQ 蛋白）都戴著一條好看的圍巾：多聚谷氨醯胺（polyQ）。這條圍巾是由基因組中的CAG三核苷酸重複序列調控編織的。在正常情況下，這樣一條圍巾的長度不會很長（短於35~45Q）【1】，但由於CAG重複序列具有一定的不穩定性，一旦發生突變，重複數過度擴張，我們的小人兒，也就是多聚谷氨醯胺蛋白，就難免不情願的戴上了過長的圍巾。這冗長的圍巾，可能讓小人兒行動不便，相互糾纏（突變蛋白聚集），直至個性突變、棄良從惡（理化性質改變，產生細胞毒性）。當細胞中拖著長長圍巾的小壞蛋越來越多，細胞就會走向毀滅（退行死亡）。

圖畫設計：Sherry

迄今為止，已有九種人類遺傳病被發現是由蛋白中polyQ區段擴張導致的，病人的神經細胞由於突變蛋白的存在而退行死亡。拿亨廷頓病（Huntington』s Disease）為例，正常的亨廷頓蛋白（HTT）佩戴的圍巾在20到30個谷氨醯胺長度，而病人由於該基因突變、CAG重複增多，圍巾長度達到36個Q（谷氨醯胺）以上，突變的HTT蛋白在神經細胞中累積，造成了紋狀體神經元的退行死亡，最終導致病人失去正常的運動控制能力。

科學家很想知道， 這條變長的圍巾，究竟如何讓使正常的小人兒發生變異，進而變成小壞蛋，去破壞細胞中正常的生命活動？可以想見，了解這一點，是認識上述遺傳病機理的關鍵。由於剖析和對比變異小人和對應正常小人的精細結構——也就是高分辨度解析polyQ蛋白結構——一直存在困難，突變polyQ蛋白的構象與其細胞毒性關係在學術界一直有爭議。近期，復旦大學生命科學學院魯伯塤課題組發表的Trends in Biochemical Sciences文章Conformation Polymorphism of Polyglutamine Proteins針對這一重要問題，回顧了近年來科學假設及其支持證據，梳理最新結構生物學和生物化學研究所得的成果，並提出了可以用來進一步闡明polyQ蛋白構象與其細胞毒性關係的新策略。

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polyQ長度與蛋白性質的關係？

由於細胞毒性根源上基本來自於polyQ蛋白谷氨醯胺鏈的過長，因為第一個重要問題是，小人兒的外形和性質如何隨圍巾增長而變化。目前科學家主要提出兩種模型來解釋突變polyQ蛋白的構象與細胞毒性之間的關係。

第一個模型被稱為線性格柵模型（The Linear Lattice Model）。科學家認為，polyQ長鏈好似鋪有整齊枕木的鐵軌，由相同的結構單元組成，而可能本身就自帶毒性，polyQ區段越長，蛋白的細胞毒性越強，達到一定程度就會造成疾病。按照我們的比喻來說，polyQ小人兒好看的圍巾中，實際上編織著一段段線性排列的含內在毒性的結構單元。

線性格柵模型主要有以下這些證據支持：

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首先，體外生化實驗和結構生物學的研究發現，polyQ的抗體可以與很短的polyQ片段（10Q）結合，而不同polyQ抗體與野生型短polyQ以及突變型長polyQ的結合模式相同【2,3】。這提示polyQ長鏈是由相同的結構單元組成。

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其次，有關蛋白功能的研究顯示，病人的發病年齡與polyQ長度有關，polyQ越長，病人的發病年齡總體來說越早【4】。另有研究表明，如果把正常小鼠Htt基因或者酵母WHI3基因的短的CAG重複完全刪除，小鼠和酵母不但沒有出現缺陷，反而延長了壽命【5,6】。

然而，該模型很難解釋為何超過一定長度的polyQ蛋白會突然產生嚴重毒性，較短的polyQ蛋白卻完全正常。而且支撐這個模型的相關體外實驗，並無法真實反映細胞中的情況。

於是，有科學家提出了第二種模型——毒性構象浮現模型（The Conformation Emergence Model），即變異蛋白的polyQ長度達到一定閾值之後，會出現與「整齊枕木」（線性結構單元）不同的新的「浮現構象」，而這種新的構象單元是導致神經毒性的主要原因【7】。按照我們的比喻就是，超過一定長度的加長款圍巾，可以扭曲纏繞成一種普通圍巾沒有的形式，讓小人兒失去「善良的本質」。

值得一提的是，毒性構象浮現並沒有否定線性格柵模型，只是推測除了線性格柵構象之外, polyQ長鏈上還出現了真正具有毒性的「浮現構象」。也就是說，同樣擁有一條過長的圍巾，有的小人兒以正常方式的纏繞，有的小人兒則選擇了有細胞毒性的樣式。如果這種模型被證實為正確，那麼突變的polyQ蛋白應當不符合安文森法則（Anfinsen』s dogma ），而是可以異常摺疊（misfolding）【8】出有毒性的構象，進而產生蛋白構象水平的多態性（Polymorphism）。

此前毒性浮現模型的支持證據主要是基於不同polyQ抗體識別的變異HTT蛋白信號與細胞毒性的相關性不同，因此推測變異HTT蛋白過長的polyQ具有多種構象，其中包括了最具毒性的「浮現構象」【7】。這類證據比較間接，我們期望能夠找出更加直接和明確的實驗事實來支持毒性構象浮現模型的正確性以及polyQ蛋白構象水平多態性的存在。

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「圍巾」長度相同，

「小人兒」個性迥異？

圖畫設計：Sherry

如何證明這種構象水平多態性的存在，並將不同蛋白構象與其細胞毒性關聯起來呢？近年復旦大學魯伯塤課題組從一個嶄新的角度研究上述問題：蛋白質降解。

細胞中，新的蛋白質小人兒在不斷地合成，完成功能的或者「錯誤摺疊」的蛋白質小人兒則被不斷地降解，生成小的肽段或氨基酸。一方面，我們可以理解，蛋白的構象很可能影響其降解速率，如果同類細胞的同一蛋白有著不同的降解速率，意味著該蛋白存在不同的構象；另一方面，蛋白降解是蛋白功能的終極調控。已有數據表明，疾病蛋白的降解速率與其神經毒性呈非常顯著的負相關，即致病蛋白降解越慢，其毒性越大【9】。因此，了解蛋白本身是否具有構象的多態性，以及不同構象蛋白的毒性是否具有「多態性」，都可以從研究蛋白的降解速率入手。

為了檢測以上假說，魯伯塤課題組選用的細胞模型是病人的真皮成纖維細胞（細胞內只含可溶性HTT蛋白單體），使用CH-chase的方法（基於點擊化學（Click Chemistry）和均相時間分辨熒光（HTRF）技術建立）追蹤蛋白的降解。研究顯示，3B5H10抗體所識別的長鏈HTT蛋白的降解，相對MW1抗體識別的HTT蛋白顯著變慢, 並且證明了其原因是這些蛋白能夠抵抗選擇性自噬作用【10】。由此，研究人員直接在突變蛋白結構和突變蛋白的細胞毒性間搭建了聯繫：一方面證明相同長度的可溶HTT蛋白能夠具有不同的構象，被不同polyQ抗體識別，另一方面發現不同構象的蛋白被自噬降解的能力不同。

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明辨閑否之潛在策略

魯伯塤實驗室蛋白降解的研究使用不同抗體，將戴著同樣長度的加長圍巾的小人兒分成了兩群，並揪出了其中一群做「壞事」的「行徑」。

我們希望能夠尋找更多的類似方法 ，一方面證明毒性構象浮現模型的正確性，一方面找出突變polyQ蛋白的致病機理。可以想見，我們不但可以基於此減少做壞事的長圍巾小人的產生，限制他們的壞行為，甚至可以運用化合物等促進壞小人兒改過自新，轉變對應的正常構象的長圍巾小人兒，最終減輕細胞退行死亡程度。

除了研究蛋白降解之外，我們還可以在使用抗體分開不同構象的蛋白之後，分別研究他們的互作組和蛋白修飾。就好像對比研究兩類不同長圍巾小人的交際圈和穿著特點一樣，通過這些研究，最終能夠讓我們明確突變polyQ蛋白中的部分小壞蛋的存在，了解他們的特徵和行為，並對此提出潛在治療策略，設法讓毒性蛋白對細胞的傷害減小和消解，最後達到治療多聚谷氨醯胺疾病的目的【11】。

復旦大學魯伯塤教授為本綜述通訊作者，馮欣然為第一作者，也是本微信文章作者、插畫及頭圖設計者。

參考文獻

1. Adegbuyiro, A. et al. (2017) Proteins containing expanded poly- glutamine tracts and neurodegenerative disease. Biochemistry 56, 1199–1217

2. Li, P. et al. (2007) The structure of a polyQ-anti-polyQ complex reveals binding according to a linear lattice model. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 381–387

3. Klein, F.A. et al. (2013) Linear and extended: a common polyglutamine conformation recognized by the three antibodies MW1, 1C2 and 3B5H10. Hum. Mol. Genet. 22, 4215–4223

4. Walker, F.O. (2007) Huntington』s disease. Lancet 369, 218–228

5. Zheng, S. et al. (2010) Deletion of the huntingtin polyglutamine stretch enhances neuronal autophagy and longevity in mice. PLoS Genet. 6, e1000838

6. Schlissel, G. et al. (2017) Aggregation of the Whi3 protein, not loss of heterochromatin, causes sterility in old yeast cells. Science 355, 1184–1187

7. Miller, J. et al. (2011) Identifying polyglutamine protein species in situ that best predict neurodegeneration. Nat. Chem. Biol. 7, 925–934

8. Moulick, R. and Udgaonkar, J.B. (2017) Identification and structural characterization of the precursor conformation of the prion protein which directly initiates misfolding and oligomerization. J. Mol. Biol. 429, 886–899

9. Tsvetkov, A.S. et al. (2013) Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nat. Chem. Biol. 9, 586–592

10. Fu, Y. et al. (2017) A toxic mutant huntingtin species is resistant to selective autophagy. Nat. Chem. Biol. 13, 1152–1154

11. Feng, X. et al. (2018) Conformation Polymorphism of Polyglutamine Proteins. Trends Biochem Sci.

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