Bai Lab晚報：Omentin-1通過下調促炎細胞因子預防炎症誘導的骨質疏鬆症

作者：Shan-Shan Rao, Yin Hu, Hui Xie et al.

期刊：Bone Research

發表日期: 2018.03.30

骨骼重塑是脊椎動物伴隨一生的生理過程，它依賴於成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收之間的平衡。當骨代謝平衡被打破時，異常骨損失和骨質疏鬆性骨折則常常容易發生，常見於類風濕性關節炎和強直性脊柱炎等運動系統慢性炎症疾病。據研究報道，慢性炎症過程中促炎症細胞因子的增加通過促進破骨細胞分化和/或抑製成骨細胞成熟和功能對骨質流失有重要貢獻。因此，抑制促炎症活性有望促進骨再生和預防炎症誘導的骨質疏鬆症。

在本項研究中，研究人員首先繁育出重組網膜蛋白-1（omentin-1）全身敲除小鼠（omentin-1 - / - ），以用於確定omentin-1在炎症和骨丟失中的作用。繼而，研究人員還評估了重組網膜蛋白-1對巨噬細胞的TNF-α誘導的炎症反應以及體外活化的巨噬細胞分泌因子介導的成骨細胞分化和破骨細胞形成的調節的影響。此外，研究人員進一步探索了炎症誘導的骨質疏鬆症小鼠模型中腺病毒介導的網膜蛋白-1遞送的治療潛力。 此項研究揭示omentin-1在炎症性骨質疏鬆症中的作用，初步闡明該過程的機制，並最終發表在著名骨科研究雜誌《Bone Research》上。

實驗結果分享

1、Omentin-1缺失誘導體內炎性骨丟失

將一個鹼基（a）a插入到外顯子4的一個鏈上的網膜蛋白-1基因序列中，導致網膜蛋白-1蛋白翻譯的提前終止。（a）對來自omentin-1 - / - 小鼠和其野生型同窩動物的尾尖的基因組DNA進行基因分型。（b） omentin-1 - / - 小鼠中的網膜蛋白-1的耗盡通過蛋白質印跡分析。驗證網膜蛋白-1 - / - 小鼠及其野生型同窩小鼠的小腸中的網膜蛋白-1蛋白的敲除效果。（c-h）免疫組織化學染色的代表性圖像，其中IL-1β，IL-6和TNF-α。omentin-1 - / - 和野生型小鼠。圖表顯示陽性染色區域的平均強度。（i）omentin-1 - / - 和野生型大鼠血清中促炎細胞因子IL-1α，IL-6和TNF-α（i-k）和抗炎因子IL-10通過ELISA所確定的。

（a）omentin-1 - / - 和野生型小鼠股骨的代表性微型計算機斷層掃描（μCT）圖像。（b-g）定量分析骨小梁部分（Tb.BV/TV），小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數量（Tb.N），小梁間距（Tb.Sp），骨膜周長（Ps.Pm）和股骨的皮質骨厚度（Ct.Th）。（h） OCN免疫組化染色的代表性圖像。（i）定量分析（h）中陽性染色區域的平均強度。（j）OCN血清濃度的ELISA。（k）蛋白在網膜蛋白-1 - / -/野生型小鼠中的TRAP染色。（l）定量分析k中TRAP +細胞的數量。BS骨表面，OCs破骨細胞。（m）CTX-1血清濃度的ELISA。

2、Omentin-1抑制巨噬細胞中TNF-a誘導的促炎因子的產生

網膜蛋白-1抑制巨噬細胞中TNF-α誘導的炎症。（a）用10ng·mL-1 TNF-α或等體積稀釋劑（PBS）處理（a-c）RAW264.7巨噬細胞30分鐘。置換培養基以去除殘留的TNF-α，然後將細胞在補充有300μg·mL-1 omentin-1或PBS的新鮮培養基中溫育24小時。通過qRT-PCR分析測試接受不同處理的RAW264.7巨噬細胞中的IL-1α，IL-1β和IL-6的mRNA水平。（d）檢測接受不同處理的巨噬細胞中IL-1β和IL-6的蛋白質水平。（e-g）來自接受不同處理的巨噬細胞的條件培養基（CM）中的IL-1α，IL-1β和IL-6的濃度。

3、Omentin-1降低TNF-a激活的巨噬細胞的抑製成骨及活化破骨的能力

網蛋白-1抑制TNF-α激活的巨噬細胞的抗成骨作用。（a）bMSCs在補充了CM的成骨培養基中培養，PBS培養的巨噬細胞（30 min + 24 h），TNF-α（10 ng·mL-1; 30 min）或TNF- -1; 30分鐘）+奧美汀-1（300μg·mL-1; 24小時）。分別在誘導3天和14天後進行鹼性磷酸酶（ALP）（a）和茜素紅S（ARS）染色（b）。（c-f）在第7天通過qRT-PCR分析檢測Runx2，OCN，ALP和RANKL的表達水平。

網膜蛋白-1下調TNF-α激活的巨噬細胞的促破骨細胞能力。（a）（30分鐘+ 24小時），TNF-α（10ng·mL-1; 30分鐘）或TNF-α（10分鐘·30分鐘）處理的巨噬細胞中添加CM的含RANKL的培養基中培養的RAW264.7細胞的TRAP染色（10 ng·mL-1; 30 min）+ omentin-1（300μg·mL-1; 24 h）。（b）定量分析a中TRAP +細胞的數量。（c-h）通過qRT-PCR分析評估破骨細胞生成相關基因（包括Trap，Mmp9，Ctsk，ATP6V0d2，Oscar和NFATc1）的表達水平。

4、網膜蛋白-1降低硅酸鎂誘導的炎症反應

網蛋白-1降低由硅酸鎂誘導的炎症反應。（a-c）對接受不同處理的小鼠的骨髓和骨表面的IL-1β，IL-6和TNF-α的免疫組織化學染色。（d-f）定量分析a-c中陽性染色區域的平均強度。（g）免疫組織化學染色CD86（促炎M1巨噬細胞的標記）。（h）定量分析g。中CD86 +細胞的數量。（i）對CD206（抗炎M2巨噬細胞的標誌物）的免疫組織化學染色。（j）定量分析i中CD206 +細胞的數量。（k）通過ELISA分析不同治療組中IL-1α的血清濃度。

5、Omentin-1預防由硅酸鎂誘發的炎症性骨質流失

網蛋白-1防止硅酸鎂誘導的炎症性骨質流失。（a）在接受不同治療的小鼠中代表性的股骨μCT圖像。（b-g）定量分析股骨中Tb.BV / TV，Tb.Th，Tb.N，Tb.Sp，Ps.Pm和Ct.Th。（h） OCN免疫組化染色的代表性圖像。（i）定量分析OCN陽性染色區域的平均強度。（j） OCN血清濃度的ELISA。（k）在接受不同治療的小鼠中進行TRAP染色。 （l）定量分析k中TRAP +細胞的數量。（m） CTX-1血清濃度的ELISA。

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