顛覆！溶瘤皰疹病毒合成起來……
1型單皰疹病毒（HSV-1）是一個已經被熟知的基因治療型病毒載體之一，我們對其疾病發病機制、臨床診斷及感染後的治療處理的研究都比較深入，HSV-1是一款安全性較高的治療型病毒載體。2015年，第一款溶瘤皰疹病毒（T-VEC）在被FDA獲批上市，近期，又有研究顯示溶瘤皰疹病毒和免疫監測點藥物（PD1/PD-L1）聯合使用可以顯著提高腫瘤的治療效果。因此，溶瘤皰疹病毒在臨床的運用進一步的被拓寬，溶瘤皰疹病毒將是一個充滿更多期待的基因治療載體。那麼，如何更好、更高效的製備、優化和改造HSV-1病毒是行業內要解決的重要問題之一！
Lauren M. Oldfield 等人在PNAS上發表研究論文，系統的闡述了一種通過分片段合成、多片段同時優化改造的方法構建目的溶瘤皰疹病毒，該方法的顯著優點是：完美的將基因合成技術和酵母重組技術進行融合，對HSV-1病毒進行快速、複雜的修飾和製備。
研究者選擇了HSV-1 KOS病毒株進行實驗，將該病毒株152kb的基因組拆分成11個片段，且順序片段與片段之間含有部分重疊序列，研究者可以分別同時對11個片段進行相關的修飾和改造，改造後的質粒共同轉入酵母菌中發生重組從而獲得完整的HSV-1病毒基因組，再將其轉入到E.coli宿主細胞中進行DNA擴增，收取DNA轉染到哺乳細胞中得到具有感染性質的完整病毒。這種在酵母中裝配基因組的病毒（KOSYA），其複製和感染能力與野生型基本一致。
1. HSV-1基因組的裝配設計
選擇HSV-1屬中的KOS序列——KOS-37 BAC（BAC質粒形式存在的KOS基因組克隆），整個基因組分成11個片段，平均每個片段14 kb。每個片段間都有80個鹼基對的重疊區域，為之後的酵母菌裝配做準備。7號片段中被修飾上BAC及YCp（酵母著絲粒序列質粒），使其在兩者中均能複製。裝配好的HSV-1基因組標記為KOSYA（KOS yeast assembled）
2. HSV-1片段的TAR克隆
通過TAR克隆與cre-loxp技術結合的方式，將11個片段分離收集，每個片段與TAR克隆載體鏈接，載體上引入PmeI酶切位點（該位點不會切斷HSV-1基因組片段），PCR驗證後轉入E.coli中培養，抽提質粒並用PCR及酶切方法驗證後，對陽性質粒測序驗證。
2. 在酵母菌中完成HSV-1基因組片段的組裝
對上述得到的基因組片段陽性質粒進行酶切，得到11個獨立片段，再將這11個基因組片段共轉染到酵母菌中，在酵母菌重組體系的作用下，按照之前設計好的片段間重疊部分，按順序依次組裝片段到對應位置，測序證明鏈接處沒有非HSV-1序列及PmeI位點的存在。轉入大腸桿菌中抽提質粒，轉入到細胞中得到完整的病毒。
3. 獲得感染性重組病毒及KOSYA的生長屬性
得到病毒後，作者進行了細胞感染，細胞出現了典型的病變跡象，結晶紫染色同樣證實了這一結論。之後作者對病毒生長活力進行檢測，發現和野生型KOS相比，KOSYA生長活力被抑制，這可能是由於YCp/BAC序列的存在，使用cre-loxp系統得到的病毒生長活力明顯恢復。這說明以這種方式合成的病毒和野生型KOS有著相同的生長屬性。同時對病毒DNA進行測序分析，與傳統方式比較，儘管在一些非編碼位點上序列有變化（傳統方式也有），但KOSYA仍然是正確的組裝。
4.探索病毒蛋白的功能與聯繫
除了可以快速得到穩定性的病毒外，作者也展示了這套系統在研究病毒功能方面上的應用。使用TAR重組法或者CRISPR-Cas9法，可在克隆片段的的基因末端融合熒光蛋白，作者通過實驗證明這並不會影響病毒的活力和蛋白的表達。通過對VP6、VP26、VP1-2的標記，並按需重組後（這裡可以同時對每個片段上的基因進行平行修飾，之後按需將片段組裝在一起），感染細胞後可通過成像方式發現不同蛋白定位在細胞的不同位置。同時應用相同的研究方法，將病毒衣殼蛋白進行修飾，單個研究或多個修飾片段一起組裝研究，可以得到病毒蛋白的相互關係。
至此，這套系統的應用平台還遠未被完全開發，方法仍然需要更進一步的迭代優化。但就像WHO委員會在2017年的報告中提到的：「從歷史的角度來看，通過對新科學技術的探索和規範，帶來的效益是遠遠大於弊端的。同樣的這套系統的的優點遠大於缺點」。除此之外，該合成技術還可以拓展至更多方面的應用，如：功能性研究，病毒載體的合成，建設疫苗及治療基因的遞送平台，該技術可以更快的發掘潛在生物治療對策。
同時作者文中承諾，對所有的成果都免費對社區開放，對此技術看好並想探索的小夥伴們，絕對不容錯過。
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