知道嗎？發酵調控還可以這樣做

引言

廣義的輔因子平衡是指藉助生化工程或代謝工程的相關技術策略，實現輔因子的轉變速率與細胞生理功能及目標代謝物合成速率的平衡。狹義是指在細胞代謝過程中輔因子對被氧化的速率與被還原的速率之間的平衡。

日常我們調控方法可能主要基於：底物抑制，碳源抑制，氮源抑制，氧氣不足等，有沒有想到這些調控手段可能是因為影響了輔因子平衡導致的代謝改變？本文將深入揭示輔因子的作用及其平衡策略。

因為發酵存在，所以我們存在

知識小貼士｜輔因子

輔因子對主要是指：NADH/NAD、NADPH/NADP、 ATP/ADP 等。它們是微生物細胞內重要的代謝因子， 作為底物或產物參與生物化學反應，通過輔因子的再生和競爭性利用，影響代謝網路、信號轉導和物質轉運，迚而影響微生物細胞的生理功能。

輔因子的生理功能

輔因子為生物合成與分解反應提供氧化還原載體，是細胞內能量傳遞的重要原料因子。 換句話說，輔因子在生物化學反應中具有重要的作用，合理控制輔因子水平有利於實現目標代謝物的高效生產[7]。根據BRENDA 資料庫 的統計結果， 輔因子NADH/NAD+、NADPH/NADP+、ATP/ADP 依賴型代謝反應的相關酶總計1610 個，主要涉及到氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、 異構酶和連接酶。

發酵優化的設計也可以通過控制胞內輔因子平衡入手：

案例1

在甘油厭氧發酵過程中，輔因子平衡主要通過兩條路徑進行維持：將電子轉移到內源產生的有機化合物和將電子轉移到還原性產物。此兩種路徑為維持輔因子平衡和還原產物的最大化生產提供了有效的通道。另一方面，共底物 (如：氰鐵酸鹽、硝酸鹽、有機酸、乙偶姻、乙醛和吩嗪) 能夠作為外源電子受體，促迚NADH的再氧化、 維持NADH/NAD比例與ATP 水平的最優化、 實現輔因子平衡。

比如在釀酒酵母發酵木糖生產乙醇的過程中，通過添加乙偶姻作為外源電子受體，有效地增加了胞內NAD+含量, 提高了乙醇的產率。

基於生化工程的輔因子平衡調控微生物胞內氧化還原態可以通過2 個方面 得以改善 (圖2)：一方面，提供能夠作為電子受體或NAD+前體的複合物，如底物氧化還原態、共底物等；另一方面，改變培養條件，如碳源、溶氧、溫度、氧化還原電位等。因此，輔因子平衡的生化工程調控策略，通常能夠控制不同氧化還原態之間的轉換，從而改善微生物對發酵條件的適應能力。

案例2

微生物胞內輔因子平衡還可以通過控制營養及環境條件來實現NADH/NAD與ATP/ADP 比例的最優化。

比如：在琥珀酸生產菌株大腸桿菌，由於丙酮酸甲酸裂 解酶 (pflB) 和乳酸脫氫酶 (ldhA) 基因的敲除，引起NAD不能再生，導致菌株生長緩慢、 代謝能力差，嚴重影響琥珀酸的生產效率。 為了解決這一問題，葉勤教授課題組設計了好氧-厭氧兩階段培養策略，即：好氧階段採用 糖異生碳源 (如：乙酸、丙酮酸、甘油等) 調節 NAD+再生能力，恢復厭氧階段快速代謝葡萄糖，從而實現了琥珀酸的高效生產。

案例3

當NADH 氧化為NAD+時， 氧作為氧化磷酸化的電子受體，通過影響輔因子相關酶的活性來維持輔因子平衡，滿足細胞代謝的能量需求。

比如：在丙酮酸發酵過低溶氧條件 (20%) 會降低NADH/NAD+的比率，導致丙酮酸的產量、產率和生產強度分別提高了68%、44%和45%

調控手段

不平衡的氧化還原路徑能夠通過以下方法使其重新達到平衡：

1) 啟動子工程，精確調控輔因子依賴型基因的表達；

2) 蛋白質工程，改善輔因子依賴型酶的特異性；3) 結構合成生物學，增強輔因子在合成路徑中的傳輸效率；

4) 系統代謝工程， 系統地探索與優化輔因子對細胞的影響；

5) 輔因子工程，重構輔因子的代謝路徑。

編者說：

除了上述5個涉及基因改造的方法外，文中引述的案例是普通發酵企業工程師可以用到的方法。對於有條件的企業或研究機構可以通過檢測胞內的輔因子的濃度進行更加深入的研究，甚至可以引入同位素，將輔因子納入代謝結構通過同位素代謝流計算獲得更加整體的數據，為更加精細的調控手段提供理論支持。後續我也會繼續關注輔因子調控方面的研究。如果您覺得有價值，轉發，您的轉發是對我們最大的支持，轉發也可以讓更多的朋友學習到本文。

參考文獻

陳修來《微生物輔因子平衡的代謝調控》

陳剛新《發酵工藝代謝調控》

王樂《代謝控制發酵生產琥珀酸研究進展》

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