胰高糖素樣肽-1在細胞增殖、凋亡中的作用及機制
文章來源：中華糖尿病雜誌, 2018,10(2) : 157-160
作者：趙愛國 劉慧蘭 劉峰
單位：深圳市光明新區人民醫院內分泌科
本文要點
◆胰高糖素樣肽-1（GLP-1）在促進胰島素分泌，促進胰島β細胞增殖，抑制血管內皮細胞凋亡，以及抵抗神經毒性從而減少神經元凋亡等方面具有重要作用
◆GLP-1的作用途徑有環磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）、磷脂醯肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）等幾條通路。GLP-1可以通過激活相關通路發揮刺激細胞增殖、抑制凋亡的作用
◆線粒體是真核生物進行氧化代謝和合成ATP的場所，線粒體在細胞凋亡過程中處於中心地位。GLP-1可以改善線粒體內環境，通過增強抗凋亡因子表達以及減少凋亡因子表達，抑制細胞凋亡
胰高糖素樣肽-1（GLP-1）是遠端迴腸、結腸和直腸L細胞分泌的一種腸促胰素，在改善2型糖尿病患者胰島β細胞功能、促進胰島素分泌、延緩併發症等方面發揮了重要作用。近年來GLP-1在細胞增殖、凋亡中的作用及其作用機製成為研究的熱點。本文將從GLP-1與信號轉導通路的關係對GLP-1的研究進展作一綜述。
一、GLP-1的生物學特性
GLP-1由胰高糖素原（proglucagon，PG）基因表達，L細胞中的前激素轉換酶（prohormoneconverting enzyme，PC）將PG剪切為其羧基端的肽鏈序列，即GLP-1。GLP-1有兩種生物活性形式：GLP-1（7-37）和GLP-1（7-36）。它們僅有一個氨基酸不同，其中80%循環活性是由GLP-1（7-36）醯胺介導。GLP-1在體內的生物半衰期非常短（t1/2[1,2]。
GLP-1受體（glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R）是一種7次跨膜的G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR），相對分子質量64 000，是Class B類一員，主要分布在胰、胃、十二指腸、Brunner腺、大小腸肌間神經叢、肺、腎血管、乳腺、心臟、腦幹、下丘腦、垂體和腦膜等組織，以環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）為第二信使。有資料顯示cAMP在基因表達、免疫反應、細胞增殖、分化中有重要作用[3,4]。在生理葡萄糖濃度下，cAMP可以通過調節下游cAMP激活交換蛋白2（exchange proteinactivated by cAMP，Epac2）的表達來調控胰島素分泌[5]。GLP-1與GLP-1R的結合過程是一個兩結構域相互作用的過程，兩者相結合，激活cAMP第二信使，刺激細胞增殖、抑制其凋亡[6]。
二、GLP-1與信號轉導通路的關係
目前發現，GLP-1的作用途徑有環磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/protein kinase A，cAMP/PKA）、磷脂醯肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated potein kinase，MAPK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）等幾條通路。GLP-1可以通過激活相關通路發揮刺激細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用。
1．cAMP/PKA通路：
GLP-1可以激活腺苷酸環化酶A（adenylate cyclase，AC），AC刺激胞內cAMP的表達，cAMP作用於cAMP依賴性蛋白激酶，即PKA，從而刺激細胞增殖。艾塞那肽可以介導PKA通路增加腫瘤壞死因子相關蛋白-3（C1q/TNF-related protein-3，CTRP-3）的表達水平，改善胰島素抵抗[7]；在2型糖尿病患者中，GLP-1不僅可以介導cAMP/PKA通路刺激胰島β細胞增殖、改善胰島素抵抗、延緩相關併發症的發生髮展。而且GLP-1在治療神經退行性病變中也有重要的作用。有研究證實，2型糖尿病可以增加患者認知損害的風險[8]。GLP-1能降低腦內β澱粉樣蛋白斑塊沉積，減輕氧化應激引起的神經細胞損傷[9]。GLP-1也可以減少晚期糖基化終末產物（advanced glycationend products，AGEs）誘導的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，升高cAMP水平，激活PKA，抑制神經膠質細胞死亡[10]。此外，心血管方面，艾塞那肽可以介導cAMP/PKA通路，抑制Rac1的激活，抑制血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）對血管平滑肌細胞的損害[11]。
2．PI3K/Akt通路：
PI3K/Akt是一條經典的細胞增殖、凋亡通路，在許多生理病理過程具有很重要的作用：（1）GLP-1可以激活原癌基因c-src[12]，繼而激活細胞膜約束的β細胞素（β cytokine，BTC），BTC激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），EGFR激活PI3K，進而激活下游的Akt[13]、PKC[14]，從而刺激β細胞增殖。（2）在脂毒性環境下，GLP-1也可以介導PI3K/Akt通路增加胰腺β細胞胞質內的p-FoxO1水平，提高細胞質/細胞核p-FoxO1的比例，從而促進胰島細胞增殖，保護胰島細胞[15]。P27基因為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，P27的過度表達會導致細胞周期的停滯和細胞凋亡。P27因子受FoxO1的調控[16]，研究表明，GLP-1可以下調P27的表達進而抑制β細胞凋亡[15]。而且，在心血管系統方面，GLP-1可以減弱終末氧化蛋白產物誘導的心肌細胞凋亡[13]。可見，GLP-1可以通過介導PI3K/Akt通路對心血管系統起保護作用。
蛋白激酶PKCδ是屬於PKC的一種亞型，是PI3K和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（3-phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）的下游靶目標。PKC能激活細胞質中的靶酶進而調控生化反應,同時作用於細胞核中的轉錄因子調控基因的表達，在細胞的增殖和凋亡中有重要的作用。Buteau等[17]證實GLP-1可激活胰島細胞中的PI3K/Akt通路導致PKC移位至細胞核，進而抑制細胞凋亡。Shigeto等[18]認為GLP-1可以通過激活磷脂酶C，從而激活PKC，刺激胰島素分泌。這種作用可能與TRPM4和TRPM5通路有關。目前關於PKC促進細胞增殖的機制還不是十分清楚，可能是通過激活NF-κB等因子刺激細胞增殖[19]。
3．MAPK通路：
MAPK通路在許多細胞增殖、凋亡中發揮了重要的作用。MAPK信號通路激活是通過執行保守的三級酶促級聯反應：磷酸化的MAP3K激活MAPKK（磷酸化），最終激活MAPK（磷酸化）。MAPK信號通路主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路。Natalicchio等[20]證實在胰島β細胞中，艾塞那肽通過減少GPCR40的表達，逆轉棕櫚酸誘導的有絲分裂素激活蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）和MKK7的磷酸化，抑制JNK和p38MAPK的磷酸化，從而抑制胰島細胞凋亡。在神經細胞中，也有類似的作用。Zhu等[21]證實利拉魯肽可以通過增加磷酸化的AKT和ERK表達，抑制磷酸化的P38和JNK表達，減少ROS的產生，降低細胞內凋亡因子caspase-3等的水平，抑制缺血造成的神經細胞凋亡，對神經系統有保護作用。
4．AMPK/mTOR通路：
AMPK即AMP激活的蛋白激酶廣泛分布在真核生物中，主要協調代謝和能量的需要，受ATP/AMP比例的調控，被稱為"細胞能量調節器"。短期效應能調節能量代謝，長期效應能調節基因轉錄。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是維持細胞生存的重要能量物質，細胞內ATP的缺失會導致細胞凋亡[22]。AMPK可以調節葡萄糖和遊離脂肪酸（free fatty acids，FFA）的攝取，改善2型糖尿病的胰島素抵抗[23]。在糖脂毒性環境下，Miao等[24]證實利拉魯肽可以上調β細胞ATP/AMP的比率，抑制AMPK的磷酸化。AMPK和雷帕黴素靶蛋白（target of rapamycin，mTOR）的磷酸化是一個相反的過程，抑制AMPK的磷酸化必然會增加mTOR的磷酸化。後者激活mTOR下游的核糖體40s小亞基S6蛋白激酶（70 000 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）、4E結合蛋白-1（4E binding protein-1，4EBP-1），刺激β細胞增殖。Kim等[25]也證實GLP-1可以抑制AMPK的磷酸化，進而通過抑制下游的P70S6K和核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，S6RP）抑制胰島細胞的凋亡。在心血管方面，Xiaotian等[26]認為艾塞那肽可以提高糖尿病患者中p-AMPK/T-AMPK的表達水平，對心肌細胞有保護作用。周越等[27]學者也證實艾塞那肽可以通過與GLP-1R相互作用發揮其抗去氯腎上腺素誘導的心肌肥厚作用，且ERK1/2信號分子及AMPK/mTOR/p70S6K信號通路參與艾塞那肽抗心肌肥厚過程。
三、GLP-1與線粒體及相關因子的關係
線粒體是真核生物進行氧化代謝和合成ATP的場所，有學者認為線粒體在細胞凋亡過程中處於中心地位。細胞內ATP的降低、胞質內Ca2+的增高以及活性氧的增加都可以引起細胞線粒體膜通透性（permeability transition，PT）的改變，進而引起線粒體跨膜電位（mitochondria transmembrane potential，Δψm）的降低。PT孔是由外膜的電位依賴性離子通道，內膜的腺苷酸轉運蛋白及基質的親環蛋白D組成的蛋白複合體。在凋亡信號的誘導下，PT持續開放，使得Δψm崩解，呼吸鏈解偶聯，線粒體基質滲透壓升高，內膜腫脹，繼而釋放細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）和凋亡誘導因子等刺激細胞凋亡。Kang等[28]證實GLP-1可以增加線粒體內的ATP、Δψm及耗氧量，提高線粒體活力。
Cyt-C是細胞氧化過程中的電子傳遞體，在酶存在的情況下對組織的氧化還原反應起到酶促作用。通常情況下Cyt-C不能進入健康細胞，但在缺氧的情況下，由於細胞和線粒體膜通透性的改變，Cyt-C便可以進入到細胞和線粒體內，提高氧的利用，從而誘導細胞凋亡，其在細胞凋亡中有很重要意義。線粒體釋放Cyt-C，使其在胞質中重新分布，Cyt-C與凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，APAF-1）形成多聚複合體。APAF-1氨基端的caspase募集結構域募集胞質中的caspase-9前體，促使其自我剪切活化，啟動caspase級聯反應，激活下游的caspase-3、caspase-7等因子，最終作用於底物核纖層蛋白、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribosepolymerase，PARP）和胞質骨架蛋白，引起細胞凋亡。實驗證實艾塞那肽可以在高糖[29]、膽汁酸[30]等環境下抑制Cyt-C的釋放，阻斷細胞凋亡進程。也可以在內質網應激環境下抑制Cyt-C的釋放，阻斷胰島β細胞凋亡進程[31]。Liu等[32]證實β澱粉樣蛋白可以增加Cyt-C表達、降低Bcl-2/Bax的表達，促進SH-SY5Y神經細胞凋亡。利拉魯肽可以介導PI3K/Akt通路降低Cyt-C水平、增加Bcl-2/Bax表達，逆轉β澱粉樣蛋白對SH-SY5Y神經細胞的毒性作用。
Caspases是近年來發現的一組存在於胞質溶膠中結構上相關的半胱氨酸蛋白，其特點是能在靶蛋白上特異的切割天冬氨酸殘基，與真核生物凋亡密切相關。Caspase可激活DNA片段化分解因子-40（DNA fragmentation factor-40，DFF-40），DFF-40進入細胞核降解DNA。其中capase-3是細胞凋亡的關鍵執行分子，caspase-3最主要的底物是多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]，該酶與DNA修復、基因完整性監護有關。在細胞凋亡啟動時，相對分子質量116 000的PARP在天冬氨酸（216位）和甘氨酸（217位）之間被caspase-3剪切成相對分子質量31 000和85 000兩個片段，使PARP中與DNA結合的兩個鋅指結構與羧基端的催化區域分離，不能發揮正常功能。結果使受PARP負調控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡。研究證實，艾塞那肽可以明顯降低caspase-3活性，抑制細胞凋亡[33,34]。
Bcl-2定位於線粒體外膜、內質網膜和外核膜，其主要作用是延長細胞的壽命，而不是刺激細胞增殖。Bcl-2的主要抗凋亡機製為：（1）調節PT孔的開放，抑制線粒體釋放凋亡物質；（2）抑制Ca2+從內質網向細胞質的流動，維持細胞質內Ca2+的穩定，抑制細胞凋亡；（3）Bax和Bcl-2基因同源，當超過一半的Bax與Bcl-2或Bcl-xl結合後，凋亡被抑制[35]；（4）抑制氧化應激反應；（5）抑制caspase的釋放。GLP-1可以通過上調Bcl-2基因，提高Bcl-2/Bax的比率，抑制AGEs誘導的人血管內皮細胞的凋亡[36]。當細胞凋亡機制啟動後，Bax從胞液遷移到線粒體，增加了線粒體膜通透性。實驗表明GLP-1可以降低Bax在線粒體內的表達，抑制細胞凋亡[30,31,32]。
四、展望
綜上所述，GLP-1促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用並不是僅僅依靠一條通路，而是多條通路共同作用的結果。但是，到目前為止，GLP-1促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用機制還不是完全清楚。在臨床實踐中，GLP-1受體激動劑已經作為治療2型糖尿病的第3線藥物寫入了2013年版中國2型糖尿病防治指南中[37]。隨著對GLP-1的進一步研究，我們會對GLP-1有一個更加全面的認識。屆時，GLP-1在治療糖尿病及相關併發症方面會發揮更重要的作用。
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