早期腫瘤cfDNA的甲基化檢測

cfDNA是由細胞凋亡後釋放到循環系統中的碎片化DNA所組成。

健康個體血漿中cfDNA來自於正常細胞釋放出的生殖細胞DNA；

癌症患者的一部分cfDNA是來自於腫瘤細胞釋放的DNA，就是通常所說的循環腫瘤DNA。

通常情況下，cfDNA中的ctDNA比例具有高度變異性，並且通常比例很低，特別是對於早期的腫瘤患者。

最近的幾項研究表明，cfDNA在腫瘤基因分型和基於血液的治療效果和耐藥性追蹤方面具有重要臨床潛力。其中最具有變革性的一項cfDNA分析潛在應用，就是從還未有臨床證據的患者體內檢測出腫瘤。這項應用在腫瘤術後殘留病灶的檢測中也表現得尤為明顯。

通過篩查術後cfDNA，查看cfDNA是否出現患者已切除腫瘤中鑒定到的特異性突變，這些腫瘤特異性突變都是使用高靈敏的檢測技術（通常能檢測到0.01%-0.1%或更低的突變頻率），能準確鑒定哪些患者最終可能會發生術後複發。

通過簡單的血液檢測，就能在癥狀出現之前檢測到早期癌症發生的可能性。當這些可能發生癌症的腫瘤患者仍可被治癒時，就可能會給腫瘤醫學帶來革命性的變化。

在目前，大多數利用cfDNA進行腫瘤檢測的研究，都是集中在腫瘤相關基因突變的檢測上。

這對早期腫瘤的檢測方法帶來許多關鍵的挑戰：

1. 早期腫瘤患者中cfDNA水平通常遠遠低於晚期患者；

2. 與上面討論殘餘病灶的情況不同，無法事先知道哪些特異性突變會出現在這些患者的腫瘤中；

3. 良性病變可能帶有與某些常見腫瘤中相同的突變，導致潛在的誤報。例如，只有7%的晚期腫瘤出現BRAF V600突變，但在良性痣中卻可以經常檢測到這種突變。

在cfDNA中，可檢測到的許多突變也可以通過一種被稱為意義未明的克隆造血過程中產生，而這種突變的數量會隨著年齡呈指數級增長。

實際也證明，在70歲以上的患者中有10-15%都發現了這種意義未明克隆造血的證據。

4. 最後，由於許多腫瘤在基因上都有比如TP53和KRAS這樣的常見突變，並且這些突變分別在50%和20%的腫瘤中都有發生。那麼在檢測到cfDNA發生突變後，如何將早期腫瘤定位到特定的器官，就面臨著巨大的挑戰。

當cfDNA的檢測聚焦於有限數量基因的突變變化時，這些技術不僅受限於分析靈敏度和特異性，而且還受到單個采血管中腫瘤基因組絕對拷貝數量的限制。如果在單個采血管中沒有採集到一個特定突變位點的DNA片段，無論多麼完美的技術，都不能識別出腫瘤的存在。

然而，考慮到大多數癌症中都普遍存在甲基化變化，同時評估數千個CpG位點也增加了在特定血液樣本中發現腫瘤衍生DNA的可能性。

另一個關鍵優勢是甲基化模式通常反映出特定腫瘤的表觀遺傳起源，並已經被用於揭示未知原發病灶腫瘤的最初發病組織。因此，如果證明檢測到了腫瘤，這種方法就可能幫助研究人員從這些數據了解腫瘤發生的來源，及早指導臨床努力定位腫瘤及進行干預治療。

在2018年4月9日發表在Annals of Oncology的研究中，美國illumina與MD安德森癌症中心合作，對通過檢測cfDNA中數千個CpG位點的甲基化狀態，進而對早期腫瘤檢測的替代方法進行了評估。

研究已經發現，在多種癌症類型中都觀察到甲基化水平普遍發生變化，某些組織來源的腫瘤顯示出特殊的甲基化狀態模式。因此，對腫瘤甲基化水平進行評估就有很多潛在優勢。開發這個方法的過程中，作者從TCGA資料庫的32種腫瘤疾病中鑒定高甲基化頻率較高的10,888個CpG位點。在排除了從健康個體分離對照cfDNA中也檢測到甲基化CpG的位點後，剩餘9,322個CpG位點用於後續分析。

簡單地說，方法是在雜交捕獲之前，對重亞硫酸鹽處理後的cfDNA進行全基因組擴增，這樣盡量保存了樣本中有限cfDNA拷貝數的分子多樣性。並再用一種新的演算法對所有CpG位點的測序數據進行分析，以確定每個樣本的單個甲基化分數。

文章中對68例未接受全身性治療的晚期癌症患者(包括結直腸癌、乳腺癌、黑素瘤和非小細胞肺癌)和66名健康對照的泛癌甲基化分析進行了評估。甲基化評分在86.6%的癌症患者中正確檢測到腫瘤，而在驗證組的25名健康個體中檢測到腫瘤的比例是0%。

更重要的是，採用基於甲基化模式的組織分類演算法，作者準確鑒定到76.3%的患者的發生腫瘤的組織來源。這項從cfDNA推斷髮生腫瘤組織起源的研究結果，突出了將甲基化分析納入血液早期檢測方法的潛在優勢。

這項研究的一個主要局限性，該試驗納入都是晚期癌症患者，而並非早期或潛在可治癒的癌症患者，而這是篩查檢測以有效方式提供治療選擇的關鍵。因而，這就需要在更多數量的早期腫瘤患者中作進一步的評估，並最終在患者個體出現癥狀之前，就能更好的評估這個方法的應用潛力。儘管如此，這項研究對於如何將DNA甲基化變化轉化成早期檢測方法，仍然是一項重要的概念驗證。

參考文獻：

Targeted Methylation Sequencing of Plasma Cell-free DNA for Cancer Detection and Classification.Ann Oncol. 2018 Apr 9. doi: 10.1093/annonc/mdy119. [Epub ahead of print]

Methylation in cell-free DNA for early cancer detection. Ann Oncol. 2018 Apr 14. doi: 10.1093/annonc/mdy134. [Epub ahead of print]

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