《自然》子刊：99.9%新葯研發失敗詛咒有望被打破！科學家終於揭秘APOE4突變導致阿爾茨海默病的奇特機制｜科學大發現

本月，NIA-AA提出了新的阿爾茨海默病研究框架，它與數十年來一直使用的方法不同。後者依賴於認知變化，如記憶喪失、空間感錯亂、認知障礙等，新的框架則是基於對生物標誌物的檢測，以實現在癥狀出現之前判斷疾病[1]。

目前，這種框架還僅用於研究，暫時不會進入臨床。但是想像一下，在這種框架之下，阿爾茨海默病或許可以像心血管疾病、糖尿病這些慢性疾病一樣，在癥狀出現之前就被早期發現，得到一定程度的控制。

畢竟對於阿爾茨海默病來說，等到癥狀出現就太晚了。

2018年，第一個終止於三期臨床的阿爾茨海默新葯出現在4月。vTv Therapeutics宣布終止其RAGE抑製劑藥物azlueragon（TTP488）的臨床研究，在試驗中，服用藥物18個月並不能改善患者的認知評分[2]。

許多AD新葯都是這樣死去的。臨床前實驗進行得很順利，在小鼠模型上藥物效果都很好，但是一應用到患者身上，卻毫無效果。99.9%的失敗詛咒籠罩在研究者們的心頭，究竟是哪裡不對，是動物模型不能完全模擬人類，還是理論從根本上就錯了？

縱然80%基因都一樣，但小鼠畢竟是小鼠

近期，來自格萊斯頓研究所的華人學者Yadong Huang團隊發表了一項最新研究成果，研究者利用來自阿爾茨海默病患者的誘導多能幹細胞（iPSC）構築了人源AD神經元模型，全面揭示了APOE4突變導致AD的機制！更令人激動的是，研究者此前開發的一款小分子結構矯正劑能夠對APOE4蛋白的錯誤結構進行矯正，有望成為AD的新療法[3]。

研究過程中，研究者還發現，iPSC神經元模型與小鼠模型的病理過程有顯著不同，說明AD在不同物種之間的表現差異很大，這很有可能是新葯接連失敗的原因之一。

Yadong Huang教授

APOE4突變是AD最大的遺傳因素之一，許多研究表明APOE4蛋白與β-澱粉樣蛋白沉澱（Aβ）和神經纖維纏結（NFTs）都有關係[4]，APOE4攜帶者患AD的風險要更高，第一次發病年齡則更低。舉個例子，攜帶APOE3雙等位基因的人，在85歲時患AD的風險約為10%，但是攜帶APOE4雙等位基因的人風險則高達65%[5]！

Huang教授便致力於研究AD與APOE4的關係。他提出了一種有關於APOE4蛋白水解的病理假說：

一般情況下，APOE蛋白是由大腦中的星形膠質細胞表達的，但是在壓力或受損的情況下，神經元也會激活APOE表達，來促進神經元的修復。而APOE4蛋白比APOE3蛋白更不穩定，更容易被水解成具有神經毒性的蛋白碎片。APOE4片段進入胞質，引起tau蛋白病變和線粒體損傷，進一步導致神經元變性。主管學習、記憶等認知功能的海馬中的GABA神經元，則是對APOE4蛋白片段的毒性特別敏感，所以AD患者首先表現為認知障礙。

實際上APOE4與正常的APOE3，在結構上只相差一個氨基酸。APOE3蛋白的112位上是一個半胱氨酸，但是APOE4蛋白的112位上卻是一個精氨酸。這直接導致在蛋白進行三維摺疊的時候，產生了不同的離子鍵，關鍵的結構域變得不一樣了。俗話說結構決定功能，所以，有研究者認為，利用一個小化學分子，「干擾」一下蛋白的結構，是有希望讓APOE4不管是結構、還是功能都回到正常的APOE3的[4]。

考慮到AD病程很長，動物模型難以囊括全程的病理變化，Huang教授選取了來自APOE4雙等位基因攜帶者和健康人的細胞，利用iPSC技術製作了AD神經元模型，並對一系列病理特徵進行了檢測。

在APOE4神經元中，完整的APOE蛋白水平要比正常神經元更低，胞內水平少了約35%，分泌出胞外的則少了大約60%。計算過二者的比例之後，研究者發現，APOE4蛋白似乎更傾向於留存在胞內，而不是分泌到胞外。

同時，研究者發現，APOE4神經元內產生的APOE蛋白片段也更多了！這些蛋白的大小在12-20kD之間，與在小鼠模型腦內和人類患者神經元中發現的蛋白片段大小差不多[6,7]！這些蛋白片段僅存於胞內，培養基內沒有檢測到。

APOE4蛋白碎片要更多

另一方面，與AD有關的兩大病理特徵，β澱粉樣蛋白沉澱（Aβ）與磷酸化tau蛋白（p-tau）在APOE4神經元中都有顯著增加，而且p-tau的增加並非受Aβ影響。當研究者利用藥物阻斷Aβ產生，p-tau水平依舊很高，並沒有隨之變化。

p-tau與Aβ在APOE4中水平較高

利用OM99-2和Copd-E兩種分泌酶阻斷劑降低Aβ水平，p-tau不受影響

分歧就出現在這裡了！研究者經過實驗驗證，認為APOE4能夠促進人類神經元中Aβ的聚集和形成，但是這種現象是不存在於小鼠神經元中的！在小鼠的iPSC神經元中，APOE4突變並不增加Aβ42與Aβ40的水平。這說明，物種之間APOE對Aβ代謝水平的影響是不同的，APOE4能夠增加人類神經元中Aβ的產生，但在小鼠神經元中就沒有這樣的效果。

對功能神經元的實驗也證實了Huang教授的假說。在APOE4神經元中，隨著神經元的逐漸分化、成熟，GABA能神經元會逐漸喪失功能或者退化，而且60%的GABA神經元中都有p-tau。

APOE4變體GABA神經元水平更低，p-tau水平更高

隨後研究者又利用基因編輯方法驗證了APOE4對神經元影響的特異性。將APOE4修復為APOE3，使得神經元的諸多AD樣病理都恢復了正常，而徹底敲除了APOE基因的「空白」神經元，生理表現則與正常的APOE3神經元基本一致；通過轉染APOE4基因，則又會令「空白」神經元產生病理狀態。

基因編輯使APOE4神經元病理指標下降

水平與正常APOE3神經元基本一致

這裡有一點十分有趣，導致病理狀態的APOE4非得是內源產生的不可。研究者給「空白」神經元輸入了人工合成的APOE4，結果並沒有引起神經元的相關變化。前文我們也說過了，正常情況下APOE蛋白是由星形膠質細胞產生的，但是在壓力、損傷等情況下，神經元也會產生APOE蛋白[4]。研究者對不同來源的APOE4蛋白進行了研究，發現APOE4毒性是神經元特異的，星形膠質細胞產生的APOE4並不會對神經元產生有害影響。

最後，Huang教授利用此前發現的結構矯正子PH002[8]嘗試「修復」APOE4神經元。實驗結果也達到了研究者的預期，神經元中APOE4蛋白片段水平下降、GABA能神經元數量上升，p-tau、Aβ42、Aβ40產生與分泌的水平都降低了！這說明，這種小分子的結構矯正劑或許可以作為一種治療AD的新手段！

小分子結構矯正劑能夠「糾正」APOE4帶來的神經元毒性

對AD的研究進程必須要抓緊了。在上個月召開的阿爾茨海默和帕金森病治療會議（AAT-AD/PD）上，梅奧診所的研究者報告說，與近幾年的研究不同，痴呆症的發病率不降反升，特別是帕金森、ALS和早發性AD，這種趨勢也很有可能延伸至遲發性AD。其他研究者的報告數據也支持了這一觀點。[9]

在對AD的預防與治療上，我們幾乎一籌莫展。Huang教授正在與製藥企業合作，對這些小分子結構矯正劑進行進一步優化，以便儘快進入臨床試驗。

期待這一天的到來。

編輯神叨叨

deadline，走一個！

參考資料：

[1]http://www.alzheimersanddementia.com/article/S1552-5260(18)30082-7/fulltext?_ga=2.217455058.555637967.1524481461-853680605.1508294454

[2]//ir.vtvtherapeutics.com/phoenix.zhtml?c=254081&p=irol-newsArticle&ID=2341681

[3] Chengzhong Wang, Ramsey Najm, Qin Xu, Dah-eun Jeong, David Walker, Maureen E. Balestra, Seo Yeon Yoon, Heidi Yuan, Gang Li, Zachary A. Miller, Bruce L. Miller, Mary J. Malloy & Yadong Huang. Gain of toxic Apolipoprotein E4 effects in Human iPSC-Derived Neurons Is Ameliorated by a Small-Molecule Structure Corrector. Nature Medicine, 2018 DOI: 10.1038/s41591-018-0004-z [4] Huang, Y. & Mucke, L. Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies.Cell 148, 1204–1222 (2012).

[5] Genin, E. et al. APOE and Alzheimer"s disease: a major gene with semidominant inheritance. Mol. Psychiatry 16, 903–907 (2011).

[6] Brecht, W. J. et al. Neuron-specifc apolipoprotein E4 proteolysis is associated with increased tau phosphorylation in brains of transgenic mice. J. Neurosci.24, 2527–2534 (2004).

[7] Harris, F. M. et al. Carboxyl-terminal-truncated apolipoprotein E4 causes Alzheimer"s-disease-like neurodegeneration and behavioral defcits in transgenic mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 10966–10971 (2003).

[8] Mahley, R. W. & Huang, Y. Small-molecule structure correctors target abnormal protein structure and function: structure corrector rescue of apolipoprotein-E4-associated neuropathology. J. Med. Chem. 55,8997–9008 (2012).

[9]https://www.alzforum.org/news/conference-coverage/alzheimers-incidence-rising-not-falling-researcher-says

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