腫瘤自身抗體標誌物的研究進展

陶生策，副院長，教授。在Nature Biotechnology 等期刊發表論文70 余篇，獲20餘項專利授權。獲「973」、「863」、「十二五」、「十三五」重大專項以及「自然科學基金」等經費支持。現為Proteomics 編委，中國醫藥生物技術協會生物晶元分會委員，中國生物化學與分子生物學會糖複合物專業委員會委員，蛋白質組學專業委員會委員。研究方向為結核病系統生物學、生物晶元及相關新技術的開發和應用。

惡性腫瘤是威脅人類生命健康的一類重大疾病。雖然經過科學家和臨床醫生的努力，腫瘤的治療有了長足的進步，但高死亡率仍未得到有效控制。根據國家癌症中心的統計數據，我國每年惡性腫瘤的新發病例約為430萬，死亡病例約為280萬。腫瘤血清學標誌物 對於腫瘤防治有重要價值，可通過篩查血清標誌物發現早期病變、進行術後評估以及術後監測等。其中，自身抗體，即機體針對腫瘤抗原發生免疫響應而產生的特異性抗體，在腫瘤的早期診斷和術後監測具有較大的應用潛力。

1　腫瘤自身抗體產生的機制

早在20世紀60年代，Baldwin發現機體可針對腫瘤產生免疫反應。經大量研究驗證，在腫瘤發生過程中，異常表達的蛋白可刺激機體免疫系統，產生抗體，這些蛋白被稱為腫瘤相關抗原（tumorassociatedantigens，TAAs） 或腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigens，TSAs），對應的抗體稱為自身抗體（autoantibody）。自身抗體產生的機制目前尚不完全明確，主流的理論假說是免疫監視理論（immune surveillance），即腫瘤在發生過程中受到免疫系統的攻擊，誘導T細胞主導的細胞免疫和B細胞主導的體液免疫。為了對抗這種攻擊，腫瘤細胞利用一系列的機制產生免疫逃逸，比如誘發免疫檢查點蛋白PD-L1通路、抑制T細胞活性。免疫治療通過抑制這種對抗或重新激活T 細胞表現出腫瘤治療的潛力。而B細胞針對腫瘤抗原產生抗體，即自身抗體，釋放到血液中（圖1）。最近的一些研究表明，B細胞及腫瘤自身抗體對於腫瘤的免疫治療或許有較大的輔助作用。能夠引起機體產生免疫反應的抗原包括異常高表達、突變、錯誤摺疊、錯誤定位以及修飾異常等的蛋白，蛋白的來源包括核蛋白、細胞質蛋白等，蛋白的種類涉及細胞周期蛋白、RNA結合蛋白以及生長因子等。

圖1　腫瘤自身抗體產生的過程

其中，p53抗體是最具代表性、研究最為廣泛的腫瘤相關自身抗體。p53是抑癌基因TP53的產物，參與細胞周期調控，引導DNA修復和細胞凋亡。已有研究表明超過50%的癌症病人中存在p53基因突變（主要發生在DNA結合結構域），突變後的蛋白失去調控功能，容易發生細胞癌變。另外，突變的p53穩定性增加（半衰期延長），導致其在細胞核中累積，從而刺激免疫反應導致自身抗體的出現。p53抗體最早由Crawford 等於1982年發現，廣泛出現在各種類型的腫瘤病人的血液中，很少在健康人中被檢測到，因此其特異性較高（96%），但跟其他自身抗體類似，p53 抗體僅在約30%的腫瘤病人中可被檢測到，因此靈敏度偏低。然而研究發現，p53抗體先於臨床癥狀幾個月至幾年即可出現，因此可用於高危人群的篩查，並且和治療有密切的相關性，可作為腫瘤複發的檢測指標。

2　自身抗體在早期診斷中的應用

自身抗體用於腫瘤早期診斷的價值已獲得廣泛認可，在多種類型的腫瘤中已經發現多個TAAs，並且有諸多綜述文獻對腫瘤（如肝癌、肺癌、食管癌、結直腸癌等）的TAAs進行了全面的總結和分析，代表性的TAAs包括p53、c-myc等抑癌基因蛋白或驅動基因蛋白、MAGE-A蛋白家族、NY-ESO-1等CT抗原（cancer-testis antigen）以及其他多種類型的蛋白。作為早期診斷的一類指標，自身抗體具有以下特點。①伴隨腫瘤的發生過程產生，先於臨床癥狀，適用於早期診斷。腫瘤的發生是一個不易察覺的過程，而目前的診斷往往基於影像學且需要有明顯的臨床癥狀作為依據。然而，自身抗體可先於臨床癥狀幾個月到幾年出現明顯增加。Zhang等基於回顧性研究發現，在肝癌病人確診之前，血清中抗核抗體水平顯著升高，針對自身抗原p62的抗體水平也是如此。Liu等同樣在肝癌病人血清中發現抗原MDM2的自身抗體，並基於一系列不同時間點的樣本檢測發現，在確診之前6 ～ 9個月，該自身抗體水平已有顯著提高。②自身抗體的產生是免疫反應的結果，經過免疫系統的放大，抗體更容易被檢測。大多數蛋白質在血液中不穩定，且含量很低。而抗體比較穩定，經過B細胞增殖的多級放大，可在一周內放大11個數量級，因此更容易被檢測。③具有特定類型腫瘤特異性。研究發現一些抗原是腫瘤特有的，但不同腫瘤間無特異性（如p53）；也有一些抗原是某種腫瘤特異性的（如前列腺癌的與氧化應激相關的蛋白）。④對於一個特定的TAA，其自身抗體僅出現在10% ～ 30%的病人中，作為診斷工具，其靈敏度偏低。這可能源於腫瘤的異質性或者免疫反應的多樣性。因此，建立一個標誌物組合，聯合多個TAAs是一種有效的策略，在維持較高特異性的前提下，提高檢測靈敏度，從而可應用於臨床診斷。例如，Zhang等建立了一個含有8個自身抗體標誌物的組合（ IMP1、IMP2、IMP3、c-myc、p53、survivin、cyclin B1 和p16），可以將檢測靈敏度提高至60%，將特異性提高到82.4%。

目前市場上已經出現了商業化試劑盒。英國Oncimmune公司推出的肺癌檢測試劑盒EarlyCDT?-Lung， 基於對7 種自身抗原（CAGE、HuD、NYESO-1、SOX-2、GBU4-5、MAGE-A4和p53） 的檢測，檢測靈敏度為41%、特異性為91%、準確度為92%，能夠與目前主流的肺癌篩查方法低劑量CT形成互補，降低其假陽性率。研究發現該產品在早期診斷中具有優勢（ 20%早期可檢測，可早於臨床癥狀5年檢測出）。基於此產品，英國國民醫療服務體系（National Health Service，NHS） 主導啟動了ECLS項目，已招募12 000名高危病人，系統性地對Early CDT?-Lung早期篩查的價值進行前瞻性評估，2016 年12月公布的初步結果顯示其具有比預期高的靈敏度和很好的早期診斷價值，整個項目完成時間在2019年。杭州凱保羅生物有限公司也成功開發了肺癌檢測試劑盒，該試劑盒包含7種自身抗體（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGE-A1，SOX-2和GBU4-5抗體）的檢測，是首個被國家食品藥品監督管理總局（CFDA） 批准的用於聯合低劑量螺旋CT的肺癌檢測試劑盒，在肺癌早期檢測領域有重要的意義（ 國械注准20153402087）。另外，美國Provista 公司（實驗室獲得CLIA和CAP認證）開發的Videssa? Breast 乳腺癌早期診斷試劑盒，包含23 個蛋白和自身抗體檢測指標，陰性預測率高達98% ～ 99.3%，可將乳房X射線的影像學檢測的假陽性率降低73%，從而減少乳腺癌的過度治療。

3　自身抗體在個體化腫瘤術後監測中的應用

腫瘤相關自身抗體在預後的臨床作用中也有諸多報道。整體上，較多報道發現p53陽性的病人呈現更高的複發率和死亡率。但是，也有的研究結論相反或顯示無顯著性影響。但是腫瘤自身抗體標誌物濃度的變化在術後複發監測過程中可能發揮很大的作用。自身抗體依賴於腫瘤的持續刺激而存在，因此，腫瘤被切除後，由於缺乏抗原的持續刺激，相應的自身抗體逐漸減少，並維持在低濃度狀態，在複發時再次增高，因此自身抗體具有複發監測的價值。其中，研究最多、最具代表性的是p53 自身抗體。

1995 年，Thierry團隊報道了一個肺癌病人血清中p53 抗體在診斷前、手術後的變化情況。在肺癌臨床診斷前幾個月，p53抗體濃度呈現逐漸升高的趨勢併到達高峰，之後採取手術治療，發現p53抗體濃度急劇下降，其下降速率接近IgG在體內自然代謝的速率（IgG在血液中的半衰期為21 ～ 30天），直到下降到接近發病之前的濃度水平。接著，該團隊在多個結腸癌病人中發現了類似的情況（圖2）。圖2展示了兩個代表性病人的情況。病人CC24［圖2（a）］接受手術治療後，p53抗體濃度出現了顯著下降並在化療的過程中維持在較低的水平，14個月後，p53抗體濃度上升，於第16個月時檢測到複發並再次實施手術，p53抗體濃度則對應再次降低，而CEA和CA199濃度則並無相關性表現。病人CC37［圖2（b）］在接受放療後，p53抗體濃度出現下降，之後腫瘤手術切除，而後又回升，發現肝臟轉移，進行手術切除後再次觀察到下降。以上均反映出p53抗體濃度與疾病進程顯著相關，而CEA和CA199濃度則並無相關性表現。該團隊後續增加了肺癌樣本的數量，系統性地分析了12個p53自身抗體陽性的肺癌病人，發現手術治療後，75%（12/16）的病人血清中的p53 抗體濃度出現了＞50%的下降，在4 個歸為未出現顯著下降的病人中，3 個被檢測到有下降的趨勢。另外，同時檢測了HAV抗體作為基線對照，從而嚴格證明了p53 抗體的變化是腫瘤進程特異的。

圖2　腫瘤病人CC24（a）和CC37（b）術後p53 抗體濃度變化曲線

Saffroy等研究了9個肝癌病人中p53抗體的變化。在8個有效的病人數據中，6個肝癌病人在手術後出現了顯著p53抗體濃度下降，但是若不考慮後續的抗體濃度波動，1 ～ 3個月內，病人均表現出p53抗體濃度下降。Takeda等在另外一項研究中，分析了17 個p53抗體陽性的病人治療前後的變化，發現所有病人血清中p53抗體濃度在術後出現下降，且16 個病人p53 抗體由陽性轉為陰性。

在大規模乳腺癌的研究中，Metcalfe等[40]檢測了1006位病人治療後血清樣本中的p53抗體，跟蹤的血清樣本總數超過8000例，結果發現在155 位p53抗體呈現陽性的病人，大部分治療後p53抗體濃度並未出現減少或消失。這個結論似乎與先前研究相反。但是，作者認為這是因為病人的治療並非採用手術切除，而是採用放射治療的方式。一方面，腫瘤細胞依然殘留；另一方面，放射治療可能對正常組織細胞造成損傷而釋放p53抗原，由於抗原的持續刺激並未消失，p53 抗體仍處於陽性。這表明治療方式可能有很大的影響，同樣是乳腺癌，在另一項研究發現p53 抗體在術後複發監測中具有重要價值。

綜上所述，p53自身抗體濃度會在手術（ 或其他治療）後出現顯著下降，並在複發前出現回升，其濃度變化跟疾病進程高度相關。雖然對於p53 抗體陽性的腫瘤病人，大部分在術後會出現抗體濃度下降，但是p53在腫瘤病人中的陽性率僅為20% ～ 30%。因此，作為術後評估較有意義。對於p53 陰性的病人，則需要尋找新的自身抗體標誌物。精準醫療是在充分考慮個體化差異的基礎上提出來的，自身抗體的特徵與腫瘤個體化差異的特點完全一致。若能比較手術前後，發現個體特異的自身抗體，即可實現個體化的複發監測，對於腫瘤防治具有重要意義。

4　發現自身抗體的方法和手段

自身抗體均是由其識別的抗原進行定義的，篩選、發現自身抗體（或抗原）的方法均基於免疫檢測，本質上是抗原庫的製備和免疫篩選的建立（圖3）。抗原的來源包括重組表達蛋白、cDNA表達庫、細胞或組織分離的蛋白質組；篩選方法主要是免疫印跡和高通量蛋白質晶元；後續基於測序或質譜的方式鑒定TAAs。主要的研究方法和工具方法如下。

圖3　腫瘤自身抗體研究的方法

4.1　SEREX

SEREX（serological analysis of tumor antigens byrecombinant cDNA expression cloning） 方法由Sahin等於1995年建立，基於從病人的腫瘤組織獲得總RNA，通過逆轉錄得到cDNA文庫，建立噬菌體克隆庫再轉染到大腸桿菌中，通過固體培養和誘導表達重組蛋白並轉移到膜上，對該病人的血清進行免疫檢測，陽性克隆通過測序獲得抗原信息。目前，應用SEREX技術，已鑒定出多種TAAs。但是該方法在建庫的過程中往往存在蛋白表達不均衡，更偏向於表達組織中高丰度的抗原，導致一些低丰度蛋白難以檢測。另外，整個實驗過程步驟繁多，抗原庫來源和血清的量都受到較大限制，因此不適用於大量樣本的篩選，無法消除個體差異以及自身抗體多樣性導致的偶然性。

類似的技術還有噬菌體庫篩選，不直接進行轉膜和血清篩選，而是採用多血清和多輪篩選的方式，一般先進行健康對照，再進行病人血清樣本的富集，獲得的陽性克隆同樣採用基因測序的方式獲得抗原信息。

4.2　SERPA

SERPA（serological proteome analysis） 直接基於組織或細胞裂解液，通過二維電泳進行分離，並進行血清的免疫印跡，陽性或差異性的蛋白通過質譜得以鑒定。該方法的優勢是基於天然樣本而非重組蛋白，因此能最大程度地保持蛋白的翻譯後修飾（PTMs）和剪切體形式。但是同樣存在蛋白丰度不均勻的問題，對於低丰度蛋白無法有效檢測，另外，實驗過程嚴重依賴人員操作，二維電泳和免疫印跡較難於重複。

4.3　 MAPPing

MAPPing（multiple affi nity protein profi ling） 基於腫瘤組織和細胞裂解液，首先用磁珠固定的健康對照組的血清去除與之結合的蛋白，再使用來自腫瘤病人的血清捕獲剩餘的蛋白，然後通過質譜鑒定。這種方法類似於噬菌體庫篩選，不同的是抗原庫源於天然樣本，無法多次篩選和富集，存在一定的假陽性和假陰性。

4.4　 蛋白質晶元技術

蛋白質晶元（protein microarray）技術根據抗原庫來源不同分為兩種形式。一是將特定抗體固定於晶元表面，首先捕獲腫瘤組織或細胞裂解液中的蛋白，再基於高通量血清學檢測獲得差異性或陽性蛋白，通過抗體的特異性確定抗原信息。優勢在於可以分析天然抗原和天然構象表位，但這種方法依賴於抗體的個數和質量，很難獲得足夠的抗原庫。另外一種是重組蛋白質晶元，即將確定的重組蛋白直接固定於晶元表面，進而進行血清學篩選，這是最直接的一種方式，同時滿足高通量和大量樣本篩選的需求。但是獲得足夠種類的重組蛋白是一個瓶頸。

5　蛋白質晶元在自身抗體檢測及研究中的應用

蛋白質晶元，或蛋白質微陣列，是將多種蛋白質以陣列的形式排布和固定在固相表面。蛋白質晶元具有高通量、微型化、樣本消耗少等優點。以目前的晶元技術，一張載玻片大小的晶元上可點制4 萬～ 6萬個點，可承載巨大的抗原庫，且由於每個點之間是獨立的，可進行直接結果解讀，適合高通量、大規模樣本的篩選和檢測。

ProtoArray?晶元是來自Thermo Fisher Scientific公司的一款高通量蛋白質晶元，包含約9000個重組人蛋白質，該晶元已經廣泛應用於多種自身免疫性疾病和腫瘤的自身抗體的研究，包括慢性腎移植損傷、哮喘、結直腸癌和前列腺癌等。

HuProtTM晶元同ProtoArray晶元相似，同是以純化的、重組表達的蛋白質製備，但是蛋白個數更多，目前已達到20 240個重組人蛋白，涵蓋約16 000個基因，是目前世界上最高通量的蛋白質晶元。HuProtTM人類蛋白質組晶元由Johns Hopkins大學的朱衡教授團隊開發，89%的蛋白為全長蛋白，部分蛋白包含多個不同的剪切體形式，通過高通量重組蛋白質製備方式獲得，表達宿主是酵母，純化方式為GST標籤親和純化。該款蛋白質晶元已應用於自身免疫性肝炎、系統性紅斑狼瘡、白塞病等自身免疫性疾病，以及胃癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的生物標誌物的發現。

圖4展示了基於HuProtTM晶元進行血清抗體檢測的原理。首先，血清以一定稀釋比例同封閉後的晶元進行孵育，並洗去未結合的抗體，再使用不同熒游標記的二抗同時檢測IgG抗體亞型和IgM抗體亞型，然後通過熒光掃描儀讀取各蛋白點的信號。

圖4　HuProtTM 蛋白質晶元用於血清自身抗體

標誌物檢測的原理

基於該款晶元，筆者課題組進行了胃癌自身抗體標誌物研究，在發現階段篩選了37例胃癌患者和50例性別和年齡匹配的健康者，發現了17個新的潛在TAAs，其自身抗體濃度在胃癌患者中顯著升高。接下來，針對這17個抗原，篩選了914例樣本，包括300例胃癌患者，200例健康者，314例胃部良性病變樣本，如胃潰瘍、胃炎和息肉。通過大樣本統計學驗證，最終確定了4個胃癌相關自身抗原，分別是COPS2、CTSF、NT5E和TERF1，其中CTSF的曲線下面積（area under curve，AUC）達到0.96，針對健康者對照的診斷特異性和靈敏度分別是88%和96%。以上結果同時通過ELISA平台得到了驗證。目前，正在同診斷公司合作進行該組標誌物臨床檢測用試劑盒的開發。在另外一項研究中，Pan 等基於HuProtTM晶元篩選了大量肺癌病人的血清樣本，經過發現、晶元驗證、ELISA驗證3 個階段，共檢測了1101例血清，發現3個自身抗體標誌物，對應抗原蛋白分別是p53、ETHE1和HRas，針對早期肺癌，檢測靈敏度47.7%，特異性為90.8%。

HuProtTM蛋白質組晶元在發現腫瘤自身抗體標誌物方面有獨特的優勢。第一，蛋白質庫較大，涵蓋近80%的編碼基因且89%的蛋白為全長蛋白，從而可保證抗原蛋白的三維構象。另外，高通量晶元使得檢測過程異常簡便，免去了抗原鑒定的複雜步驟，通過晶元掃描即可獲取全部蛋白抗原的自身抗體信號。簡便的過程使得系統誤差較小，因此可保證實驗的一致性。第二，適用於大規模樣本篩選。微型化的晶元可同時進行多個樣本的並行分析，傳統方法則很難同時進行多個樣本的檢測。一方面自身抗體存在較大個體差異，小樣本量篩選或將樣本混合以獲得統計學結果必然降低篩選的成功率；另一方面，在研究同一病人不同時間點的一系列樣本時，需要同時檢測多個樣本。第三，所消耗的樣本量較少。由於微型化，檢測所有蛋白所需要的血清樣本量僅為100μL以下，極大節省了寶貴的臨床樣本。因此，HuProtTM晶元是一個高效的自身抗體研究工具，可大大提高標誌物篩選的覆蓋率和效率，在疾病相關標誌物發現領域有較大應用潛力。

6　總結和展望

腫瘤自身抗體的產生是腫瘤發生過程中機體免疫應答的結果。諸多研究表明，自身抗體往往出現在腫瘤發生的早期，因此具有真正意義上的早期診斷的潛力。目前，多個腫瘤相關性抗原已被發現和鑒定，並且肺癌早期篩查上已經出現了商業化產品。除此之外，自身抗體在術後監測過程中可能發揮更大的作用。自身抗體依賴於腫瘤的持續刺激而存在，因此，腫瘤被切除後，自身抗體逐漸減少，並維持在低濃度狀態，在複發時濃度再次升高，因此自身抗體可用於複發監測；但是，由於個體差異，不同腫瘤病人的自身抗原可能不同，所以必須以精準醫療的思維實施個體化篩查和監測。然而，受限於研究工具和樣本的可獲得性，該類研究目前僅局限於p53等特定TAAs，目前並未進行廣泛地篩選以建立全面覆蓋的個體化複發監測的標誌物組合。

腫瘤自身抗體研究依賴於抗原庫，傳統的方法已不能滿足全局性的篩查和大規模樣本驗證。蛋白質晶元，特別是包含有約20 000個重組人蛋白的HuProtTM晶元提供了高效的方式，可進行大量樣本的快速篩選和驗證，有望推動自身抗體作為標誌物的研究進程。

腫瘤相關性自身抗體領域仍有諸多問題未被解決。比如，目前自身抗體產生的分子機制仍不清晰；所產生的自身抗體，是否具備抗腫瘤作用，還是具備其他功能。另外，在腫瘤免疫治療的大背景下，有報道發現，自身抗體的存在與否可以預測免疫治療的效果，或許具備伴隨診斷的價值。基於T細胞的免疫治療研究進行得如火如荼，但仍只對部分人群有效，隨著技術的進步和對腫瘤免疫機制研究的深入，或許將來基於自身抗體的免疫治療也能成為一種有效的治療方式。

全文刊登於《生物產業技術》2018年第2期

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