你認識生物學裡的SHERLOCK么？

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是一種古細菌的獲得性免疫方式。其中II型CRISPR/Cas免疫系統的發現，使RNA介導的基因組編輯技術成為簡單、方便、快速的功能基因組學研究工具。

CRISPR/CAS9工作原理

CRISPR最早在細菌和古細菌中被發現，很可能是是生物體為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防禦機制。入侵病毒的短DNA序列（spacers）插入的細菌基因組的CRISPR基因位點，從而充當初次感染的「記憶子」。再次感染會激發補充成熟CRISPR RNA(crRNA)尋找匹配的序列，CAS蛋白會將外源DNA切割下來、形成雙鏈斷裂。簡而言之，crisp-cas是將一個外源的DNA片段去整合到目標自身體內，然後再把它去合成能識別一個特異性DNA的剪刀。

圖1：大家熟知的Cas9工作原理

CRISPR/CAS13a

發展到現在，CAS9已經做到切割效益提升到非常高，脫靶效益非常低，且在哺乳動物體內也已經實現。而我們今天要講的則是CRISPR/CAS13a。CRISPR/CAS13a是一種在2015年被發現的蛋白，它的發現被nature評為年度十佳文獻。

CRISPR/CAS13a的工作原理

與CAS9不同的是，CAS13a識別並切割的是RNA，也就是實現了RNA層面上的操作。它作為系統的靶向目標是RNA，在細菌中也是作為免疫系統的存在。當它發現外源的RNA存在時，它會通過這個系統去識別它，並且通過CAS13a去切割。然而，CAS13a也有它自身的缺點：在細菌當中，當CAS13a被激活切割時，還有一個附帶效應存在——除了目標RNA、許多無辜的RNA也被一同切割下來，最終可能導致細菌的裂解死亡。

圖2：CAS13原理圖(Abudayyeh, Gootenberg et al. 2016)

雖然有自身的缺點，但是相比之下，CAS13a與其他的RNA編輯工具，例如shRNA編輯相比，CAS13a切除效率更高，更精確。

圖3：與shRNA的效益比較(Abudayyeh, Gootenberg et al. 2017)

然而，在細菌中會有的切割效應在哺乳動物中也會有么？實驗驚喜地發現，在哺乳動物當中，CAS13a附帶的切割效應幾乎沒有，也就是幾乎不會造成其他RNA的脫靶。這個長足的優點正是我們需要的，這樣我們就可以讓它想切哪就切哪。

SHERLOCK的前世今生——從CRISPR/dCas9改造應用中獲得靈感

看到現在你可能要問：我們的神探怎麼還沒有出現？別急，秉持著刨根尋底的科學探究精神，我們就要從故事主角的前世今生開始講——正所謂沒有條件就創造條件是人的主觀能動，大前輩dCAS9是對天然的CAS9蛋白其中一個切割活性區進行部分改造，讓它不會造成DNA的雙鏈斷裂，然後再人為地往cas9蛋白上加一個啟動子或蛋白抑製劑，再用熒光蛋白表示其丰度。

圖4：SHERLOCK的大前輩，dCAS9的工作原理

受到dCAS9的啟發，也就可以想到對CAS13進行改造，一個想法就是去掉一部分CAS13的切割活性位點，並加上ADAR，實現將RNA片段的A(腺苷)→I（肌苷）來替換。而由於I（肌苷）在體內是被識別為G（鳥苷），最終實現了一個A→G的轉換。這個方法被命名為RNA Editing for Programmable A to I Replacement (REPAIR)。

圖4：A(腺苷)→I（肌苷）的化學過程(Gaudelli, Komor et al. 2017)

就這樣，得到了初代的REPAIR後，仍存在脫靶率高、且有些G被改造成了A的問題等。科學家又對ADAR2進行了突變篩選，最終得到了第二代——它被命名為Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK)。它的脫靶效率非常低，且能精確實現A→G的改變。這個意義相當重大，因為人類疾病單鹼基突變中有48%都可以靠大部分的改變都只能實現A,T→G,C轉變來治癒。

圖5：Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK)工作原理 (Gootenberg, Abudayyeh et al. 2017)

實驗中使用CAS13a去檢測RNA的存在和丰度，它的應用主要有檢查寨卡病毒、登革熱病毒這兩種RNA病毒，以檢測感染情況。原理就是在CAS9上加一個reportor，用來檢測RNA的存在或者丰度。

以寨卡病毒為例，寨卡病毒是一種RNA病毒，寨卡病毒有非洲型和美洲型兩種，首先把它們的crRNA序列找出來之後，加到CRISPR的基因序列當中，最後去合成CAS13a，以此實現一個識別RNA的系統。

圖6：對寨卡病毒兩種亞型的檢測 (Gootenberg, Abudayyeh et al. 2017)

這聽上去平平無奇，但是寨卡病毒是一種潛伏期長、活動隱秘的病毒，在漫長的潛伏期中癥狀幾乎沒有或者輕微，而爆發後就來勢洶洶，因此經常疏於早期檢測。考慮到其爆發的地區多為衛生條件落後的國家，很難做到早期檢測，那有什麼辦法能讓普通人做到自檢？——於是科學家們把CRISPR/CAS13a製作成一個可以冷凍保存的試紙類的檢測工具，一個隨叫隨到的「偵探」。只需要通過人體內的唾液、尿液就可以檢測，這樣就可以在疫情爆發的地區快速檢測病毒的感染情況，對於初步預防報告、在醫療人員到之前控制疫情的爆發有很大的潛力。

作者：李沛霖

編輯：張譯雲

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