2018Cell Stem Cell：類器官培養揭示胰腺癌進展過程對幹細胞微環境因子依賴性的丟失

編者導語

體外傳統的二維細胞培養技術廣泛應用於生物醫學研究，然而離體的二維培養的細胞無法模擬在體的三維結構與微環境，存在諸多局限性。近年來，體外三維類器官培養技術的建立與優化是幹細胞生物學與組織工程領域一個重要的突破，正逐步開始應用於生物醫學研究的各個領域。最近，日本慶應義塾大學Toshiro Sata實驗室在胰腺癌的類器官培養領域取得了重要的進展，在Cell Stem Cell雜誌發表了題為「Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression」的論文。在該研究中，作者首先建立了39例胰腺導管癌的類器官（Organoids）；根據細胞因子的依賴情況，這些胰腺導管癌的類器官培養物分成了三大類（Wnt與R-Spondin依賴型、Wnt依賴型、Wnt與R-Spondin均不依賴型），提示胰腺導管癌對Wnt信號通路依賴性的異質性；最後，也是該研究的一大亮點，作者利用CRISPR knock in與knock out技術重現了胰腺導管癌進展過程中遺傳變異導致幹細胞微環境依賴性逐步丟失的現象。

關鍵詞：類器官培養；胰腺癌；微環境

內容簡介

摘要

主要發現

1、人胰腺癌類器官庫的建立和起源驗證

研究人員利用手術、細針抽吸活檢和腹水的樣本建立了人胰腺癌和臨近正常組織的類器官。根據先前所報道的培養條件，研究人員採用了無血清的Afamin穩定性Wnt3a培養基，使得類器官的穩定培養時間超過了8個月。利用這種培養策略，研究人員建立了包含49種人源胰腺腫瘤類器官系的胰腺癌類器官庫。 在最初的實驗中，研究人員觀察到正常胰腺組織從胰腺導管腺癌PDAC樣本中長出，這種「污染」正常類器官的生長在先前胰腺癌和前列腺癌類器官的研究中都出現過，考慮到KRAS基因突變在胰腺癌中的普遍性，研究人員首次採用了無表皮生長因子EGF的培養條件從而起到擴大KRAS基因突變胰腺癌類器官的作用，因為EGF的受體EGFR是KRAS的上游基因，能夠導致KRAS基因的活化，所以培養體系中EGF的去除能夠有效起到富集KRAS基因突變胰腺癌類器官的作用，並且可以直接觀察到，除此之外，研究人員利用加入Nutlin（一種MDM2抑製劑）以及去除Noggin或加入BMP4篩選出TP53、SMAD4基因突變的突變胰腺癌類器官。利用以上培養條件和微環境生長因子篩選方法，研究人員在人胰腺癌類器官中庫得到了39種可以作為PDAC類器官，剩下的10種類器官表觀出對微環境生長因子嚴格的依賴性，所以被定義為「類似正常」（normal-like, NL）類器官。

為了鑒定這種基於微環境生長因子，研究人員利用全外顯子測序和比較基因組微陣列的方法分析了所建立的類器官的遺傳狀態，結果發現PDAC類器官在公認的驅動基因的突變頻率方面保持了預期的水平—KRAS (36/38); CDKN2A(31/38); TP53 (29/38); and SMAD4 (14/38），同時研究人員在NL類器官沒有發現驅動基因的重新突變，證實了PDAC類器官篩選的準確性。在接下來的拷貝數變異分析中，研究人員發現NL類器官全部都表現出染色體整倍性，進一步印證了其非癌症起源的特徵，而大多數PDAC類器官都表現出染色體異常的特徵，但實驗中有四種PDAC類器官也表現出了染色體整倍性或近似整倍性的特徵，其中的三種出現了KRAS基因突變，證明了其癌症來源的特徵，剩下的一種近似整倍性類器官缺乏驅動基因的突變，所以其致癌機制尚不明確。

2、基於不同微環境生長因子依賴性的PDAC類器官亞群分類

為了找到決定PDAC類器官生長的關鍵幾種類器官，研究人員對PDAC類器官進行了連續的基於微環境生長因子的處理，同時也為了說明驅動基因的突變導致了PDAC類器官對相應微環境生長因子的依賴，結果發現，Wnt/R-spondin因子的依賴和PDAC類器官中Wnt信號通路的基因突變無關，14種類器官的生長要求Wnt和R-spondin的同時添加，剩下的R-spondin依賴性的PDAC類器官可以在沒有Wnt3a的條件下生長，這種表型說明R-spondin依賴性的PDAC類器官可以通過自分泌和外源添加的方式進行生長，因此研究人員基於對外源Wnt3a的需求將R-spondin依賴性的PDAC類器官分成了Wnt不分泌型（W-）和Wnt分泌型（W+）。為了證實W+PDAC類器官的Wnt產生能力，研究人員利用Wnt配體活性抑製劑（Porcn-i; C59），在實驗中，Porcn-i處理抑制了W+PDAC類器官的生長和Wnt靶向基因的表達水平，而這些表型都能夠被外源添加Wnt3a逆轉，並且在沒有外源添加Wnt3a的情況下，W+PDAC類器官的Wnt靶向基因表達水平要顯著高於W-PDAC類器官，W+PDAC類器官和GFP標記的W+PDAC類器官的共培養實驗也證實了W+PDAC類器官能夠自我分泌Wnt微環境生長因子。

研究人員接下來將目光聚焦於Wnt和R-spondin均依賴性的PDAC類器官（WRi），利用Wnt-β-catenin下游通路抑製劑ICG001分析WRi PDAC類器官的生長是否需要Wnt信號的激活，在ICG001的處理下，W-PDAC類器官和WR+ PDAC類器官不可逆地停止生長，這與它們需要Wnt信號的激活的情況是一致的，而WRi PDAC類器官存活了下來，說明Wnt信號的激活對這種類型的PDAC類器官的生長是非必須的。

以上結果成功將已建立的PDAC類器官基於對Wnt和R-spondin的依賴性分成了三種亞型。

3、癌相關成纖維細胞為PDAC提供了Wnt配體

雖然W-PDAC類器官需要外源的Wnt配體保障其存活和生長，但這些Wnt配體的來源尚未可知，由於PDAC以基底細胞浸潤為特徵，所以研究人員推測這些基底細胞能夠通過產生Wnt支持PDAC的生長，研究人員利用癌相關成纖維細胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）作為研究材料，證明了其是來源於基底，為了研究這些CAFs時候能夠支持W-PDAC類器官的生長，研究人員將解離的PDAC細胞和CAFs進行了共培養，結果發現W-PDAC類器官能夠在沒有外源添加Wnt3a的情況下生長，而Porcn-i處理消除了這種生長促進作用。為了在體外進一步證實CAFs對PDAC類器官的促進致瘤的作用，PDAC類器官被進行了皮下移植，分成添加CAFs和不添加CAFs兩種情況，在CAFs缺失的情況下，W+PDAC類器官和WRi PDAC類器官都能夠有效成瘤，而W-PDAC類器官不能成瘤，說明了Wnt微環境生長因子對腫瘤形成的必要性，而在添加CAFs實驗組中，三種PDAC類器官均順利成瘤。

4、上皮的Wnt配體表達與PDAC的臨床發展有關

與W-PDAC類器官相比，W+PDAC類器官能夠自我產生Wnt配體，為了研究表達在PDAC類器官中Wnt配體的具體類型，研究人員利用微晶元分析的方法，最終篩選出了6種Wnt配體，為了研究這些Wnt配體是否能夠作為上皮的Wnt微環境生長因子，研究人員在NL類器官中過表達了每種Wnt配體並分析了它們對促進微環境生長因子的潛能，最終發現WNT3, WNT7A, WNT7B, and WNT10A能夠替代Wnt3a，所以這些Wnt配體被定義為了上皮性Wnt配體，並且它們在W+PDAC類器官和WRi PDAC類器官的表達水平顯著高於W-PDAC類器官，說明了上皮性Wnt配體與Wnt微環境生長因子依賴性的關聯。

為了研究這些上皮性Wnt配體能否表達在臨床樣本中，我們利用轉錄組資料庫分析了它們在PDAC組織中的表達水平，結果發現WNT2, WNT2B, WNT4, 和WNT5A在PDAC組織中表達但卻幾乎不能在類器官中被檢測到，類器官和CAFs中的qPCR分析證實了這種組織特異性的表達模式。

為了研究上皮性Wnt配體的差異表達情況，研究人員進行了上皮性Wnt配體的原位雜交實驗，結果發現WNT7B 和WNT10A在W+PDAC的上皮部分中顯著表達，而在W-PDAC和臨近的正常胰腺組織中幾乎不表達，並且這些上皮性Wnt配體的高表達與極差的生存率和惡化進展關係密切，以上結果說明W+PDAC細胞能夠通過表達上皮性Wnt配體自我激活Wnt信號通路，從而預測了胰腺癌的惡性表現。

5、Wnt配體依賴性與基因表達亞型相關

為了研究形成每種PDAC功能亞型的機制，研究人員對PTOL進行了轉錄組分析，利用t-分布領域嵌入演算法（tSNE）研究人員發現了與Wnt微環境生長因子亞型一致的線性基因表達簇，說明了調控Wnt微環境生長因子依賴性的轉錄程序的存在，先前的研究證明不同的PDAC分子亞型是基於基因表達模式的，研究人員接下來分析了Wnt微環境生長因子依賴亞型是否反映了不同的基因表達亞型，結果發現經典/類似間葉細胞（basal/QM）（胰腺癌的分子亞型之一，惡性程度和生存率均差於經典型）基因表達程度和經典型（basal）基因表達程度的比例隨著Wnt微環境生長因子的依賴性的喪失呈現出上升的趨勢，先前發表的一篇論文中研究人員發現一種GATA-6的表達在QM胰腺癌亞型中被表觀沉默了，預示了GATA-6表達在決定胰腺癌分子亞型中的重要作用，研究人員發現GATA-6的表達與Wnt微環境生長因子依賴性的程度有關聯，DNA甲基化的分析結果也表明GATA-6的DNA甲基化程度與Wnt微環境生長因子亞型一致，GATA-6的靶向基因FOXA2也表現出了類似的趨勢，以上結果表明Wnt微環境生長因子非依賴性對GATA-6依賴的表觀遺傳調控關係的存在。

6、在W+PDAC類器官中GATA-6的表達調控了上皮性Wnt配體的表達

為了研究GATA-6的表達水平是否與區分分子亞型和Wnt產生能力相關，研究人員利用shRNA和CRISPR-Cas9技術在W-PDAC類器官中對GATA-6進行了KD和KO，由於GATA-6存在兩種轉錄同型體（GATA6L，片段較長；GATA6S，片段較短），由於實驗採用的sgRNAS只能靶向GATA6L，所以在KO實驗中，GATA6S的表達仍然存在，數據表明KD和KO實驗都是成功的，隨著GATA6的下調，W-PDAC類器官獲得了Wnt自我激活的能力，WNT7B表達量顯著上調，這些結果暗示在PDAC中GATA-6依賴的轉錄程序調控了Wnt依賴性。

研究人員接下來研究了Wnt配體與GATA-6調控表達的臨床關聯，在兩種獨立的W+PDAC樣本中，免疫染色在GATA-6陰性區域和陽性區域表現出了不同的表達模式，並且這些GATA-6陽性病灶缺失了WNT10A和WNT7B的表達，說明了在臨床樣本中GATA-6對Wnt配體的負向調控，在公共資料庫中對GATA-6和Wnt配體也進一步證實了以上結果。

7、通過驅動基因工程誘導人胰腺類器官向W-PDAC進行轉化

之前的實驗數據說明患者來源的PDAC類器官可以通過啟動基因突變和GATA-6轉錄重編程從而獲得微環境生長因子非依賴性，為了進一步證實，研究人員利用CRISPR-Cas9技術和培養條件篩選的方法獲得了攜帶有驅動基因突變的類器官—KC，KT，KCT，KCTS，轉錄組分析證實了PDAC類器官和工程類器官在驅動基因突變和其靶向基因表達變異方面的近似一致性。為了研究這些工程類器官的致瘤能力，KC，KT和KCTS被外植到免疫缺陷小鼠的皮下，KC組致瘤失敗，KT組需要與CAFs共同外植才能致瘤，並且表現出了良性的特徵，而KCTS組在沒有CAFs的情況下成功緻瘤，並且表現出與PDAC一致的組織學特徵，由於四種驅動基因突變賦予了工程類器官突變特異性微環境生長因子非依賴性，但其仍然需要Wnt保證其正常生長，在去除外源添加Wnt配體1-3周後，KC和KT組類器官無法生存，而KCT和KCTS生存了下來並且在無Wnt配體的培養體系中緩慢生長，另外，基因表達分析發現，在適應無Wnt配體培養體系的過程中，GATA-6逐漸下調，而WNT7B逐漸上調，說明在這種適應的過程存活下來的類器官逐漸獲得了GATA-6的抑制和Wnt微環境生長因子的自我產生能力。

總結

PPPR

一、Senky的評論：

這篇文章雖然不是胰腺癌類器官領域的開創性論文，但筆者認為其創新性還是非常高的，研究人員不再是根據以往的模式展現類器官培養的成功性以及與原腫瘤在病理學和遺傳學方面的一致性，而是利用類器官進行開創性的研究，發現了PDAC的惡性程度與微環境生長因子非依賴性的直接關聯性，也證明了GATA-6與這種非依賴性獲得的關係，並且根據Wnt微環境生長因子這個核心，發現了CAFs對胰腺癌的支持作用，同時利用CRISPR-Cas9技術對實驗所得出結論進行了驗證，筆者感覺研究人員所提出的「工程類器官」的概念甚是新穎，很有開創性，但作者在工程類器官中敲除或者敲低GATA-6來進一步驗證之前得出的結論，並且作者在實驗中發現了沒有拷貝數變異和驅動基因突變的PDAC類器官，但並沒有對其進行更多的解釋，不過我們也不能要求一篇文章是完美的，這篇文章在筆者看來已經是非常厲害了，工作量也很大，同時根據文章的結論我們可以在臨床中對胰腺癌進行分型，並利用所提到的多個靶點，對其進行精準治療，這也是非常具有臨床價值的。

二、悟空的評論：

關於類器官（organoid）研究的文章已經越來越見諸報道。前期的文章主要集中在使用organoid技術建立不同器官的培養體系，而本文則拓展於應用：在建立了胰腺癌類器官體系後，根據胰腺癌的表達Wnt的不同，成功將實驗樣本分成了三種亞型。文章還使用了CRISPR-Cas9技術對類器官亞型的表觀遺傳調控機制進行了研究，發現類器官中相關基因的甲基化變化與腫瘤體系一致。總之，這篇文章著重闡述了類器官技術的實際應用，不失為一篇很有意義的文章。

三、Lee的評論：

Toshiro Sato師承類器官培養的鼻祖之一（也是Wnt信號通路研究大牛）Hans Clevers，回到日本後繼續在類器官培養領域發揚光大，最近幾年裡發表了多篇高影響因子的研究論文。這篇文章很可能是作者近期與Hans Clevers的乳腺癌類器官生物庫背靠背一起投稿Cell，但這篇文章被拒才transfer到Cell Stem Cell。目前國內類器官培養領域似乎還未見重量級的研究報道，或許各路諸侯都在躍躍欲試吧。

Note：如果有熟悉該研究領域的讀者，歡迎您留言評論，我們在會第一時間精選顯示出來。

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