高齡妊娠之痛：源於土壤貧瘠的生命樹之凋零
在第七期內容中，我們向大家介紹了Myriam Hemberger實驗室的最新研究成果：大多數基因突變造成胚胎或胎兒死亡的原因是胎盤發育障礙1。該研究成果是胎盤研究領域的重大突破！為此，我們研究組為本文撰寫了亮點述評（Highlight），並於近日在線發表於Biology of Reproduction（BoR）2（見圖1）。
其實任何一項劃時代的偉大發現都不是一蹴而就的，而是在先前大量研究的基礎上做出的新的重要發現。回顧Hemberger實驗室的研究歷史，我們發現其實早在去年（2017年），就有一篇類似立意的文章發表於Nature Communication3。仔細研讀後收穫頗豐，現將該工作介紹給大家。
高齡妊娠之痛
母親高齡是妊娠失敗最重要的獨立風險因素。在生活節奏較快的發達國家和地區，晚婚晚育已成為趨勢，由此帶來的妊娠失敗問題越發引人關注。2013年的一項研究表明，英國頭胎母親的平均年齡已經超過了30歲，其中20%超過了35歲，在北美和其它地區也出現了類似的情況。高齡母親卵母細胞中染色體分離不正常，從而導致後代核型非整倍性，這通常被認為是高齡妊娠失敗的原因。
同時，母親高齡也使得妊娠後期罹患妊娠相關疾病的風險大大增加，包括流產、胎兒圍產期死亡、死產、早產、低出生體重、胎盤植入和子癇前期等3。35歲以上產子，早產的幾率要提高約20%。即便是妊娠結束後，母親的高齡和多種後代出生缺陷，特別是先天性心臟病、橫膈膜疝、尿道下裂和頭骨畸形等密切相關。有一點需要明確，妊娠後期出現的胎兒發育異常通常和其染色體核型異常沒有關係，母親高齡生產所致後代出生缺陷的原因仍不得而知。值得一提的是，母親高齡所引起的妊娠疾病，如胎兒發育受限（FGR）、低出生體重、子癇前期和死產等，均有著共同的根源，那就是：胎盤發育異常4。除卻胎盤在維持胎兒生長發育方面的關鍵作用，胎盤也和某些胎兒臟器的發育緊密相連，特別是胎心。在很多研究中均已證實，野生型的胎盤能夠挽救基因突變胚胎的心臟發育異常5。值得回味的是，近期的一項流行病學調研表明，高齡母親所致後代先天心臟病的風險在於母體本身，而不在於卵母細胞6。與此相符的，在將高齡母親的受精卵移植到「年輕」的子宮內進行發育，高齡母親所致後代心臟室中隔缺損的風險會大大降低。
由此，作者推測，胎盤發育異常可能是導致高齡所致妊娠疾病的重要原因，特別是在染色體核型正常的情況下。
文章亮點述評
1
高齡妊娠致胚胎和胎盤發育缺陷
作者分析了40隻42至54周齡的高齡孕鼠（Aa），並以8-12周齡的年輕孕鼠（Y）作為對照。結果發現，約2/3高齡雌鼠的E11.5胚胎存在不同程度的發育異常，其中最顯著的是胎兒發育受限，其次還有心臟水腫、腦和神經管閉合異常、血管疾病如背主動脈和/或腦血管擴張，以及胚胎吸收率明顯增加等。而這些後代異常在年輕雌鼠組內是觀察不到的。若將年輕雌鼠和52周齡的雄鼠進行交配（An），其後代也觀察不到上述發育異常現象，表明後代發育異常和母親的高齡有關，而和父親無關（見圖2）。
圖2.高齡雌鼠多發後代缺陷，高齡雄鼠後代基本正常
由於上述觀察到的後代缺陷均報道與胎盤發育異常有關，為此作者對胎盤進行了病理切片H&E染色、滋養層巨細胞標誌物Proliferin（prl2c2）原位雜交，以及多種滋養層細胞譜系標誌物的表達研究。結果表明，高齡雌鼠的胚胎胎盤存在重大缺陷，表現為由滋養層細胞發育而來的胎盤迷路層厚度顯著下降，提示滋養層細胞分化不良；滋養層細胞譜系標誌物的表達研究更進一步地確證了這一結論（見圖3）。全轉錄組RNA-seq的測序結果表明，An組的數據處於Aa和Y組之間。該結果提示，儘管An組胎盤外觀看起來基本正常，其實胎盤滋養層細胞基因表達譜已經出現了異常。這可能會導致妊娠後期多發妊娠疾病，甚至後代出生缺陷。
圖3.H&E染色、prl2c2原位雜交以及滋養層細胞譜系標誌物表達研究發現高齡雌鼠胚胎胎盤存在重大缺陷
2
年輕母親代孕能挽救高齡妊娠缺陷的表型
由於高齡雌鼠胚胎胎盤發育異常出現較晚，以及缺陷表型彼此相似，作者判定上述缺陷應該不是染色體核型異常所導致的；為此，作者將工作重心轉移到分析母親因素所致後代缺陷上來。
作者收集了高齡雌鼠著床前的E2.5胚胎，並移植到8-10周齡的假孕雌鼠子宮中（A>Y）；並以年輕雌鼠E2.5胚胎移植到年輕假孕雌鼠子宮中（Y>Y）作為對照。結果表明，高齡雌鼠胚胎若在年輕雌鼠子宮內發育能挽救絕大部分胚胎和胎盤的發育異常（見圖4）。因此作者認為，高齡雌鼠後代缺陷不是因為卵母細胞「老化」，而是因為宮內環境不良所導致的。
圖4.高齡雌鼠胚胎在年輕雌鼠子宮內發育能挽救胚胎和胎盤的發育異常
3
蛻膜化異常是高齡所致後代缺陷的主要原因
在哺乳動物胎盤內，胎兒來源的滋養層細胞和母體細胞接觸、互作，共同促進胎兒的發育。胎盤內的母體細胞是子宮內膜細胞在接觸早期胚胎後通過嚴格控制的蛻膜化過程演變而來的。蛻膜化涉及子宮內膜基質細胞的增殖和分化，最終形成個體較大的上皮樣蛻膜細胞。該過程對母胎對話的建立和著床的順利進行而言異常重要。蛻膜化過程既能限制滋養層細胞的過度侵潤，也能通過分泌生長因子和細胞因子重塑著床位點和母體血管，而對胎盤、胎兒的發育起到支持作用。該過程和一系列特殊免疫細胞的功能是密不可分的。
由於作者發現導致大多數後代缺陷的原因源於母體，因此作者採用全轉錄組RNA-seq方法分析了高齡雌鼠和年輕雌鼠E11.5胎盤的蛻膜部分。結果表明，高齡雌鼠蛻膜中78個基因異常高表達，84個基因異常低表達。其中包括和蛻膜分化密切相關的基因，如Bmp2、Gdf10、前列腺素D和E的受體（Ptgdr，Ptger3），以及介導雌激素誘導子宮內膜生長的重要生長因子Igf1等（見圖5）。經過Gene Ontology（GO）和信號通路分析，作者發現，較多的差異表達基因聚集在Bmp2附近，信號通路多為生長因子相關通路（信號轉導、二硫鍵和胞外基質構成等）（見圖6）。作者通過實時定量PCR實驗有針對性的驗證了其中一些重要基因，包括Il15受體α（Il15ra）和Il15——調節子宮NK細胞（uNK）成熟的重要細胞因子。
圖5.全轉錄組RNA-seq揭示高齡雌鼠E11.5的蛻膜基因表達異常
圖6.採用MsigDB資料庫對高齡雌鼠和年輕雌鼠E11.5的蛻膜組織進行GeneOntology（GO）和基因聚類分析
差異基因分析結果表明，高齡雌鼠不僅僅是蛻膜化過程出現了異常，實際上問題出的更早，因為差異表達基因中的一些是在更早期發育過程中發揮作用的。比如Bmp2和Igf1是在發育的更早期階段高表達，但在蛻膜化過程中其表達就已經開始下降了。為此，作者對年輕雌鼠E9.5-E12.5的蛻膜進行了額外的轉錄組RNA-seq測序，並與上述取得的高齡雌鼠和年輕雌鼠E11.5蛻膜的轉錄組測序結果進行比對。結果表明，高齡雌鼠E11.5蛻膜轉錄組數據更接近於年輕雌鼠E9.5-E10.5的蛻膜。更精確點說，45-47周齡雌鼠的E11.5蛻膜更接近於年輕雌鼠E9.5的蛻膜；而43周齡雌鼠的數據則更接近於年輕雌鼠E10.5的蛻膜（見圖7）。因此可以說，相比於年輕雌鼠，高齡雌鼠的蛻膜發育滯後了1-2天。
圖7.高齡雌鼠E11.5的蛻膜發育相對滯後
4
母親年齡和子宮駐留免疫細構成改變密切相關
為了探究高齡雌鼠蛻膜發育滯後的原因，作者分析了蛻膜中淋巴細胞的構成情況。已有報道指出，高齡會影響NK細胞的成熟和功能發揮7。並且，作者發現和NK細胞存活密切相關的Il15ra和Il15在高齡雌鼠蛻膜中均表達異常。蛻膜中數量最多的淋巴細胞是子宮NK細胞（uNK）。和外周NK細胞相比，uNK細胞殺傷能力減弱，分泌能力增強。uNK細胞在螺旋動脈改建和分泌促血管生成因子等方面發揮著重要作用。蛻膜中uNK細胞的數目在妊娠中期達到頂峰（約佔當時蛻膜所有淋巴細胞的20%）8。此外，蛻膜中還存在巨噬細胞和樹突狀細胞（DCs）等，但其對妊娠維持的作用目前仍知之甚少。
作者通過一系列流式分選策略將巨噬細胞、DCs和uNK細胞分離開（見圖8）。高齡雌鼠蛻膜中淋巴細胞數目整體略有下降，而這下降主要是由巨噬細胞和DCs的數目減少導致的；與此同時，調控巨噬細胞和DCs的重要細胞因子Csf1的表達有所降低。令人意外的是，作者沒有觀察到uNK細胞的數目有明顯變化。CD11b染色結果表明，高齡雌鼠蛻膜中uNK的成熟和年輕雌鼠無異。與此相對的是，高齡雌鼠脾臟中的外周NK細胞數目卻是顯著降低的，特別是CD11b+亞群。
圖8.高齡雌鼠蛻膜中淋巴細胞總數、巨噬細胞數和樹突狀細胞（DCs）數均顯著降低，但uNK細胞數基本保持不變
5
高齡雌鼠子宮基質細胞對蛻膜化反應遲鈍
為了探明妊娠早期子宮內膜的發育狀況，並儘可能排除胚胎可能造成的影響，作者將高齡雌鼠、年輕雌鼠和輸精管切除的雄鼠進行交配，由此得到的假孕鼠子宮內沒有胚胎，但子宮內膜細胞仍會進行增殖分化。作者取得雌鼠E3.5時的子宮進行轉錄組RNA-seq分析，結果表明，高齡雌鼠蛻膜化相關基因在E3.5時就已經出現失調（見圖9）。其中Bmp2、Hand2、Hoxa10、Hoxa11、Ptch1、Areg和Foxa2在高齡雌鼠子宮中降調，甚至在沒有著床胚胎刺激的情況下仍是如此；而Wnt4、Hbegf和Cdh1則是升調的。作者將該結果和Bmp2、孕酮受體Pgr、Egfr和Wnt4敲除小鼠的轉錄組結果進行比對（這4種基因敲除小鼠均表現出蛻膜化異常）後發現，它們之間呈現明顯的相互重疊現象。聚類分析表明，異常表達的基因通常集中於糖蛋白、分泌蛋白儲備、胞外基質構成、細胞膜成分和Bmp2調節因子等（見圖9）。
圖9.高齡雌鼠蛻膜化相關基因在E3.5時就已經出現失調
據報道，Bmp2對蛻膜細胞增殖有影響9。為此，作者分離了E3.5的子宮基質細胞並在體外進行培養。結果發現，高齡雌鼠來源子宮基質細胞的增殖能力顯著降低。E3.5時子宮的Ki67染色也印證了這一發現。但高齡雌鼠子宮腔上皮卻有大量的Ki67陽性細胞，表明其受孕酮刺激後表皮——基質細胞轉換的增殖活性並沒有在高齡雌鼠子宮內激活（見圖10）。
圖1.高齡雌鼠E3.5子宮基質細胞的增殖能力顯著降低
6
子宮基質細胞對激素響應不足導致蛻膜化異常
蛻膜化早期的基因表達變化主要是受雌激素和孕激素調控的10。高齡雌鼠早期蛻膜化相關基因Bmp2和Hoxa10的失調，以及上皮——基質細胞轉換及增殖異常均提示，高齡雌鼠子宮內膜的激素響應能力可能不足。作者對高齡雌鼠蛻膜異常表達的基因進行分析後發現，超過50%的失調基因均有雌激素受體Esr1和/或Pgr的結合位點，提示它們可能被雌激素或孕酮調控。儘管Pgr，特別是最主要的Pgr-A亞型，在高齡雌鼠蛻膜中的表達並沒有發生明顯改變，但其分布卻和年輕雌鼠有著顯著不同。E6.5時，年輕雌鼠次級蛻膜區（secondary decidual zone）已經有大量Pgr分布；但在高齡雌鼠中，Pgr的分布仍局限於靠近孕體的初級蛻膜區（primary decidual zone）（見圖11）。
圖11.高齡雌鼠蛻膜失調基因大多受雌激素受體（Esr1）和孕激素受體（Pgr）調控，並且高齡雌鼠蛻膜中Pgr的定位僅局限於初級蛻膜區
當作者用E2、P4和cAMP處理從年輕雌鼠分離的子宮基質細胞後，後者的增殖能力降低，並起始分化；但該現象無法在從高齡雌鼠分離的子宮基質細胞中觀察到，表明高齡雌鼠的子宮基質細胞對激素刺激的響應不足。作者將處理2天和4天的細胞進行蛻膜化標誌物表達分析後發現，高齡雌鼠子宮基質細胞中Prl8a2（Dtprp）、Bmp2、Hand2、Hoxa10、Nr2f2（Coup-tfII）、Igfbp5和Sfrp5的表達均是顯著下調的。
為了探明高齡導致子宮基質細胞對激素響應不足的原因，作者分析了pStat3/Stat3——能夠激活Pgr靶基因並起始蛻膜化的重要分子。結果發現，高齡雌鼠子宮基質細胞中pStat3的量是顯著降低的；並且pStat3的定位也和年輕雌鼠不同：高齡雌鼠子宮基質細胞中pStat3基本不定位在核內，而年輕雌鼠則恰恰相反（見圖12）。而核定位是pStat3正常發揮功能的前提條件。
圖12.高齡雌鼠子宮基質細胞對雌激素、孕激素的響應能力降低
總結和展望
在這篇文章中，作者揭示了高齡雌鼠後代多發缺陷的原因：子宮基質細胞對激素的響應不良，從而導致蛻膜化滯後。由於蛻膜在維持胎兒胎盤生長發育中具有重要作用，蛻膜化不足會對胎兒胎盤的正常發育造成嚴重影響。該結論再次刷新了我們的認知，使我們更清楚的認識到蛻膜、胎盤在胎兒發育過程中的地位和作用（見圖13）。
圖13.高齡雌鼠子宮基質細胞對激素響應不足導致蛻膜化異常，繼而導致胎盤發育障礙和胚胎多發缺陷
Hemberger教授通過他們開創性的研究，強有力地證明：胎盤對胚胎的正常發育固然重要，而作為胚胎種植的土壤，子宮對激素的準確反應性和恰當的分化能夠決定胎盤乃至胎兒發育的成敗。高齡妊娠情況下胎兒發育異常或妊娠疾病高發，其重要原因在於子宮這一「土壤」的貧瘠。目前這方面的研究是相對滯後的，亟待深入認識子宮在胚胎/胎盤發育中的作用及其機制，揭示發育疾病的根源，並以此探究預防和治療發育缺陷、提高生殖健康水平的根本策略。
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生命樹之謎：
中國科學院動物研究所生殖病理學研究組
BOSS簡介：
http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html
Lab簡介：
http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling/
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