北大陳匡時課題組在基於 CRISPR 的單分子成像 DNA 技術領域取得新進展

北京大學工學院生物醫學工程系陳匡時課題組基於 CRISPR 基因編輯技術與分子信標（MB）研製出一種名為 CRISPR/MB 的新型單基因位點成像技術。該研究成果已發表於 Nucleic Acids Research (《核酸研究》)（IF = 10.162），題目為「A CRISPR/Molecular Beacon Hybrid System for Live-Cell Genomic Imaging」。

CRISPR 基因編輯技術是一種能夠有效且穩定地將目的基因敲除的方法。該技術是由 Cas9 蛋白與 single-guideRNA (sgRNA) 組成。Cas9 是一種 DNA 內切酶,sgRNA 則同時具有能和特定基因組序列互補的位點 (spacer 序列) 以及和 Cas9 結合的結構域。因此，Cas9 在與 sgRNA 形成複合體後能通過 spacer 序列靶向特定基因位點並將其破壞，從而達到定點編輯基因組的目的。前人的研究發現，失去酶切活性的 Cas9（nuclease-deactivated Cas9, dCas9）也能夠通過結合 sgRNA 靶向特定基因組，由此開創了使用 dCas9 與 sgRNA 成像特定基因組的研究領域。

目前，基於 CRISPR 技術在活細胞中標記基因組的方法主要通過將熒光蛋白連接於 dCas9 或 sgRNA 上實現成像。但是熒光蛋白具有亮度低、易被光漂白以及不能被淬滅等缺點，在單分子成像單基因位點上能力有限。本研究所使用的分子信標（MB）則是一種基於化學熒光基團、具有可淬滅特性的寡核苷酸探針（圖 1），其兩端分別連有一個化學熒光基團和一個淬滅基團，在不與目的 RNA 結合時 MB 通過自身形成莖環結構呈現出低熒光狀態，而在與目的 RNA 互補後莖結構解離進入高熒光狀態，MB 因其獨特的成像優勢成為目前活細胞標記內源 RNA 的主要手段之一。通過改造 sgRNA 的結構，陳匡時實驗室巧妙地將 MB 與 CRISPR 技術結合起來，成功研製出帶有 MB 靶序列 (MTS) 的 sgRNA (SL2-sgRNA-MTS)，並證實 dCas9 和 SL2-sgRNA-MTS 能形成穩定的複合體，並與特定的單基因位點結合。MB 進入細胞後能與複合體中的 MTS 互補，使得該基因位點被熒游標記。熒光成像顯示，被標記後的單基因位點在傳統熒光顯微鏡下呈現單一亮點 (圖 2)。CRISPR/MB 的研發與應用有望幫助研究者對目的基因組在細胞核的轉運與定位，及其與疾病的發生髮展的關係等科學問題進行更深入的闡述。

圖 1：CRISPR/MB 的工作原理。CRISPR/MB 由 dCas9,MB 以及一個帶有 MB 靶序列（簡稱 MTS，綠色）的 sgRNA 組成。dCas9-sgRNA 複合體通過 sgRNA 的 spacer 序列（紫色）結合基因位點後，MB 與 MTS 的互補使得該基因位點被熒游標記。

圖 2：通過 CRISPR/MB 在細胞中檢測特定基因位點。A-B)CRISPR/MB 對單一端粒的成像。C)CRISPR/MB 相較於傳統熒光蛋白標記手段具有更高的光穩定性。D)CRISPR/MB 對端粒（telomere）以及著絲粒（centromere）的雙色標記。

該工作的第一作者是吳小天，毛詩琦、楊艷濤等學生為工作的順利完成作出重要貢獻。通訊作者為陳匡時特聘研究員。此項工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、北京市自然科學基金以及青年千人啟動經費的支持。

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