讓人震撼的「細菌畫「與那些背後的故事

你能相信嗎，細菌竟然也可以作畫，成為藝術品！而那些背後的故事更是跌宕起伏！

（用細菌作的畫）

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五彩繽紛的細菌畫

在我們的春季分子生物學實驗課上， 同學們用菌種在培養皿上塗鴉，令人意外地成為五彩繽紛的藝術品。請先看我的這幅 「示範」：

這裡有6種不同顏色的細菌，它們是用牙籤作畫筆，將菌種「畫」在瓊脂培養皿上的。在畫的時候，字母和數字都要反寫，經過一夜37度的培養，然後再在紫外燈光下拍照，才成為這樣的平皿 「藝術品「。

再看看兩位學中文的學生寫的中國字：

可愛吧？

大家不禁會問，這些細菌為什麼會發光，而且還是不同顏色的光呢？

這些細菌之所以能發光，是因為在這些細菌的細胞中，轉進去了一種叫做 「質粒」 的環狀DNA：

這些細菌其實就是人們所熟知的 「大腸桿菌」 (E. coli)，它們是單細胞的。而轉入細菌的質粒DNA ，攜帶了兩個重要的基因，一個是青黴素的抗性基因 (AmpR), 另一個是綠色熒光蛋白基因（Green Fluorescent Protein, GFP）。在培養這些 「轉基因」 的細菌時，加入了微量的青黴素，將那些不含有質粒 DNA 的細菌殺死，那些活下來的細菌，就是既抗青黴素，又能產生綠色熒光蛋白的個體。這些「轉基因」的細菌經過一夜的繁殖（大腸桿菌每20分種就繁殖一代），許多相同顏色的細菌聚在一起，就成為這些蔚為壯觀的 「藝術品」了。

這些細菌能夠發出不同顏色熒光的關鍵是，它們被轉進了不同的 「綠色熒光蛋白基因」。那這個 「綠色熒光蛋白基因」 倒底是是怎麼回事呢？

綠色熒光蛋白基因和它的發現經過是這樣的。

2

努力工作卻做了一個錯誤的假說

每年六、七月份，在美國西北太平洋海岸邊，都會出現成千上萬的水晶水母。它們直徑不超過10厘米，沒有頭，沒有有毒的觸角，全身都是透明的，在海水中自由自在地搖曳著。當受到驚擾的時候，它們會在傘型身體的下緣發出一束束綠光。夏天一過它們又全都消失。日出日落，潮漲潮退，年復一年，周而復始，好像從遠古到未來，永遠都不會改變。

直到二十世紀六十年代初，美國普林斯頓大學的法蘭克.約翰孫 (Frank Johnson) 教授實驗室的日裔訪問學者下村修（Osamu Shimomura）, 對這些小生物的發光現象發生了興趣。他花了將近20年的時間，每年夏季和家人從東海岸的普林斯頓一路開車到西海岸，在華盛頓大學的 「星期五港」 實驗室外的棧橋上，大批大批地捕撈這些水晶水母。回到實驗室，他又忙著把水母的傘蓋下緣切下來，不厭其煩地分離和分析各種成分。剪切，擠壓，過濾，攪拌，沉澱......，經過幾十次實驗後，他終於弄清楚了綠色熒光的奧秘：

水母有兩個發光蛋白，第一個他命名為水母素（aequorin），是一個熒光素酶，在碰到鈣離子時會發出藍光。第二個就是綠色熒光蛋白或 GFP。水母素髮出的藍光作為能量會傳給 GFP，激發出綠色熒光。但 GFP 的含量在水母中遠低於水母素，從水母中提取 GFP 更加耗時耗力。

非常奇妙的是，當水母素被注射進藤壺 （生活在海邊岩石上的一種節肢動物）的肌肉細胞和烏賊的神經細胞時，當肌肉收縮時或是神經細胞放電時，人們第一次在細胞里清楚地看到了明亮的藍色閃光。

科學界意識到了發光蛋白的可能應用，但每一篇論文雖然只需要幾毫克的水母素，卻需要幾萬隻水母來提煉。這種昂貴的技術註定無法普及。

下村修當時只對水母素感興趣，並不在意 GFP。他提出了一個假說：GFP 蛋白僅靠它自己不能發熒光，需要水母體內的酶加工才會變成熒光蛋白。

如果這個假說成立，GFP 在生物科研中的用處就不大了，因為它在其它生物個體中無法獨立發光。但遺憾的是，該假說雖然完全是錯誤的，當時卻被普遍接受，這對以後 GFP 的研發有著極為深遠的負面影響。再加上GFP 蛋白提取困難，在隨後的20 多年裡，GFP的科研幾乎沒有任何進展。

GFP從人們的視野里消失了！

轉進了 GFP 基因的小鼠

3

史上最悲壯的論文

GFP 研究過程中最關鍵的一個人物是比下村修小23歲的 Douglas Prasher 博士。Prasher 在喬治亞大學的 Milton Cormier 實驗室作博士後時，就成功地從水母中找到並克隆了水母素的基因，並用該基因在大腸桿菌了生產出了水母素蛋白。

這是一個不小的成就。與從水母中提取蛋白相比，用細菌生產、製備蛋白要方便、省時、省力和便宜得多，也人道得多。任何實驗室想要用水母素作為鈣離子的感測器，都可以直接用細菌生產或以合理的價格購買。水母素的來源不再是一個瓶頸，直到今天它仍在實驗中被廣泛用來檢測鈣離子。

轉進了不同顏色 GFP 的人體培養細胞

後來 Prasher 也在伍茲霍爾海洋研究所建立了自己的實驗室。他開始把目光投向了無人問津的 GFP。他產生了一個獨特的想法，如果下村修的假說不成立呢？

也許 GFP 本身就能發熒光，並不需要水母的其它蛋白處理加工。如果這樣，GFP 就可以通過基因拼接的方式，附著在任何蛋白的末端。而目標蛋白在活細胞內，甚至是個體內的一切生理狀態下的活動，都能被看得清清楚楚，就像時時刻刻有一盞探照燈照著它。

而那時候人們還沒有任何手段追蹤蛋白在活細胞或活體里的動態變化。驗證這一想法的第一步就是克隆 GFP 的基因。基因是用來編碼蛋白質的，它是所有蛋白質的程序源。有了基因，後續工作就容易了。

Prasher 把自己的想法寫成了科研計劃，申請了科研基金項目。但他的設想與佔主導地位的理論背道而馳，因而他不斷碰壁，申請一次次被拒絕。但功夫不負有心人，最終他從美國癌症協會獲得了20 萬美金的科研基金來支持這個項目。

從80年代初起，Prasher 也開始一次次地在初夏前往西海岸 「星期五港」 實驗室，大批大批地撈水晶水母。但 Prasher 與下村修的差異是，下村修感興趣的是蛋白，而 Prasher 搜尋的是 GFP 的基因。

由於在當時的條件下，很多現在普及的分子生物學方法還沒有被發明，Prasher 的工作量與下村修相比只多不少。

轉了 GFP 基因的植物

在將近3年的時間裡，Prasher 先從約 7 萬隻水母中提取了足夠的RNA 建立了水晶水母的互補基因文庫（cDNA library），再用同位素標記的探針雜交的方法來大海撈針。一遍遍地嘗試，一遍遍地失敗，再嘗試，再失敗。直到他拿到了完整的 GFP 基因。

他將GFP基因轉到了大腸桿菌里表達，又提取了 GFP 蛋白。

但理想很美麗，結果卻很殘酷：GFP 並不能發出綠色的熒光！看來下村修的理論是對的。他本來就有些動搖的自信心遭到致命一擊。

Prasher 是一個孤獨的科學家，他不擅於和同行交流。他和下村修在同一個研究所共事多年，研究的課題緊密相關，但兩人只談過一次話，還是在遠離研究所的一次會議上。在他苦悶的時候，在他的實驗走到瓶頸的時候，他無人可以傾訴，無人可以交流。

這時候他的 20 萬科研基金也用完了，再申請又被拒絕。他心灰意冷，徹底放棄了GFP。

但在 Prasher 徹底告別 GFP 之前，他還是把克隆 GFP 基因的過程和結果寫成了一篇論文，於1992年發表。在論文中，他承認了GFP 本身並不發熒光，下村修的理論是對的。這可能是歷史上最悲壯的一篇論文，在看似無邊的黑暗和疲倦中，Prasher 不知道他與綠色的曙光有多麼接近。

Prasher 於 1992 年發表了 「歷史上最悲壯的論文」。

4

踩在別人肩膀上的科學家

Prasher 的這篇論文引起了兩位同行的注意：哥倫比亞大學的生物學家 Martin Chalfie 和加州大學聖地亞哥分校的錢永健（Roger Tsien）教授。兩個教授都發電子信件向 Prasher 索要 GFP 基因。Prasher 毫不猶豫、無條件地給兩個實驗室寄去了。

Chalfie 是研究線蟲的專家。線蟲約一毫米長，經常被用作模型來研究動物的發育過程和初級神經系統。它的一大優勢就是全身上下是透明的，這是驗證熒光蛋白標記技術最理想的動物模型。

轉了 GFP 基因的線蟲

Chalfie 得到GFP 的DNA 後，把它交給在實驗室里工作的研究生Ghia Euskirchen。Euskirchen發現Prasher 的 GFP 基因並不齊整，在首尾各多了一些鹼基，因此它表達的蛋白並不是天然的 GFP 蛋白，而是延長版的 GFP，前後都有些多餘的氨基酸。

原來 Prasher 在把 GFP 基因插到表達質粒上時，用了當時的通行方法，用兩個限制性內切酶切出來含有 GFP 基因的 DNA 片段，再接到質粒上。這一方法雖然方便，但不精確。

為了精確地把 GFP 基因插到表達質粒上，Euskirchen 使用了剛發明不久還沒有普及的 PCR 技術。對於基因剪拼來說，限制酶方法是用斧頭砍，接縫的地方總是多一塊或少一塊，而 PCR 方法則是激光刀，可以把一個基因準確地切割下來，一個鹼基不多，一個鹼基不少。她把 GFP 基因嚴絲合縫地插入到質粒里。

令她大吃一驚的是，攜帶該質粒的細菌在培養的時候就是綠色的，在熒光顯微鏡下觀察竟然發出明亮的綠熒光。Euskirchen 成為世界上第一個在大腸桿菌中看到 GFP 熒光的人。

GFP 蛋白的結構

至此，下村修的理論被證明是錯誤的！

GFP 不需要其它酶加工，它的三個氨基酸構成光核或發色團，而蛋白的其餘部分摺疊成一個桶狀，將發色團圍在中間，就象一個有燈罩的檯燈一樣。而Prasher 的GFP 蛋白由於首尾多了一些氨基酸，在細菌中不能形成正確的桶狀結構，就發不了熒光。

Chalfie 的團隊迅速地用 GFP 標記了線蟲對接觸敏感的蛋白，觀察到它在線蟲體內神經細胞的表達。這一成果1994 年發表在《科學》雜誌上，Prasher 由於提供了基因，被列為論文的最後作者。那期《科學》的封面就是一張在黑色的背景中發綠色熒光的線蟲的照片。

文章的發表引起了世界性的轟動。千千萬萬個學者為這張照片而痴迷。用 GFP 作為工具監測活的生物個體里的基因表達和蛋白變化，為解決無數個生命不解之謎提供了鑰匙。

發表 Chalfie 論文的那期《科學》雜誌封面

5

五顏六色的加強版 GFP

錢永健差不多同一時間得到 Prasher 的 GFP 基因，但卻沒有立刻開展這個項目。

錢永健是錢學森的侄子，在美國出生，16 歲就獲得西屋科學獎。他是化學方面的專家，他的實驗室缺乏有生物背景的人。錢永健在等他剛招的生物博士後 Roger Heim 來做這個項目。在 Heim 還沒有加入錢的實驗室之前，錢永健就聽說了Chalfie 的實驗室在 GFP 上取得的突破。他們決定另闢蹊徑，在酵母里表達GFP。

錢永健（1952.2.1-2016.8.24）

另外他們以 GFP 為基礎，構建了一系列的突變蛋白，產生包括藍色，黃色和青色等不同顏色的熒光。這樣在同一實驗中，兩個或三個不同的蛋白可以同時被跟蹤監測。

他們還在 GFP 蛋白里置換了一系列的氨基酸，大大提高了GFP 的穩定性和發光強度。在今天生物醫學研究中使用的 GFP ，大部分都是錢永健實驗室研製出的加強版 GFP。

如果說 Chalfie 的那篇《科學》論文是向世界宣告一個工具的誕生，那錢永健的工作就是使這個工具更好用，更方便。洪水之門一下子被打開了，使用熒光蛋白技術的論文呈幾何級數增長。當今發表的生物醫藥領域科研成果中，有一半以上都用到這一技術。

2008 年10 月，瑞典皇家學院宣布諾貝爾化學獎將被授予對 GFP 的發現和應用有突出貢獻的三位科學家：下村修、Chalfie 和錢永健。而起了關鍵作用的Prasher 卻遺憾地與諾貝爾獎失之交臂。

更令人感慨的是，Prasher 此時已不再從事與科學有關的工作。他在阿拉巴馬州的一家豐田車行打工，開班車接送客人，掙著最低工資。

原來在放棄了 GFP 項目不久，Prasher 離開了伍茲霍爾海洋研究所，在阿拉巴馬州找到一份政府科研的工作。但不幸的是，由於政府撤銷了對該科研項目的投資，Prasher 失去了這份工作。他又不想離開那個城市，但那裡的科研工作機會實在有限。為了養家糊口，Prasher 無奈放棄了科學，找到了這份臨時工。

Chalfie 和錢在記者採訪和後來的諾貝爾獎演講時，都強調了 Prasher 的關鍵作用。錢永健邀請並資助了Prasher 一家去瑞典參加諾貝爾獎頒獎典禮。後來Prasher 又重返科研，在錢永健的實驗室工作。

改了行的 Douglas Prasher 博士

6

在黑暗中躑躅而行的寂寥身影

GFP 的故事令人感慨萬千。對這一段歷史，也許每個人得到的啟示都不一樣！

下村修在一次又一次地提取水母中的發光蛋白時，他只想去解決生命的奧秘之一。一旦 GFP 的機理被弄清楚了，GFP 蛋白標記技術就水到渠成呼之欲出。Chalfie 的論文完成了由科學到技術蛻變的第一步，而錢永健的實驗室和實用加強版 GFP 的基因則完成了第二步：新興技術的成熟化和產業化。

在 GFP 的發現和推廣的過程中，下村修是開拓者，Prasher 起到承前啟後的作用，Chalfie證實了自己的遠見，錢永健善於改進，而Euskirchen 和 Heim 擁有一流的實驗設計和執行能力。

科學有時很殘酷，Prasher 在 GFP 技術的發展中起到了關鍵作用，但功虧一簣，痛失諾貝爾獎。在大眾的眼裡，他無疑是一個悲劇的角色。在車行打工，一小時掙 10 美元，與獲得諾貝爾獎及其帶來的榮耀和 120 萬美金，只有一線之差。

在漫漫的科技歷史長河中，既有牛頓和愛因斯坦這樣燦若星辰照亮世界的天才人物，也有像 Prasher 這樣在黑暗中躑躅而行的寂寥身影。

你能告訴我嗎，Prasher 缺少的是什麼？

主要參考文獻：

朱勇：「史上最悲壯論文」，班車司機與諾貝爾獎

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楊振寧、莫言等聯袂推薦，第一部關於民國大師們的集體傳記 ——《南渡北歸》

《南渡北歸》分為《南渡》、《北歸》、《離別》三部，系首部全景再現中國最後一批大師群體命運劇烈變遷的史詩巨著，描繪了抗日戰爭時期流亡西南的知識分子與民族精英多樣的命運和學術追求，作者為前台灣清華大學駐校作家、中華考古文學協會副會長岳南。

所謂「南渡」，是指上個世紀大批知識分子冒著抗戰的炮火由中原遷往西南之地；而「北歸」，則是指他們再回歸中原的故事；第三部講的是民國時期的知識分子在1949年歷史分野的十字路口，何去何從的決策，及其走上不同的道路之後，各自命運的遭遇和劇變。

整部作品的時間跨度近一個世紀，所涉人物囊括了二十世紀人文科學領域的大部分大師級人物，如蔡元培、王國維、梁啟超、梅貽琦、陳寅恪、錢鍾書等。作品對這些知識分子群體命運作了細緻的探查與披露，對各種因緣際會和埋藏於歷史深處的人事糾葛、愛恨情仇進行了有理有據的釋解，讀來令人心胸豁然開朗的同時，又不勝唏噓，扼腕浩嘆。

眾多文史大家鼎力推薦，莫言、楊振寧、俞敏洪、茅於軾、張鳴、李國慶、李存葆、朱向前、張志忠、刑軍紀、徐貴祥、王久辛、趙琪、李炳銀、王良瑛、彭學明、張頤武、何亮亮…… 聯袂推薦。

楊振寧感言：這個書很不錯，寫了那麼多人，那麼多事，注釋那麼多，不容易。我經歷了那個時代，但有好多事不知道，看了這部書之後才知道。比如書中說的饒毓泰、葉企孫，他們都是我那個時侯的老師。在西南聯大大三的時候，熱學是跟葉企孫念的，光學是跟饒毓泰念的，他們兩個人後來在中國大陸生命際遇很困難的時候，有些是我不知道的。岳南做了一件了不起的工作，值得稱讚。

莫言感嘆：《南渡北歸》有豐富的文史價值。那個時代的大師了不起，令人敬仰。

柳傳志表示：「岳南的《南渡北歸》，對我影響很大。我們至今不能全面反思文革，令人尤為痛心。這套書盡量真實地從某一個角度描繪當年的歷史，文筆也好，很好看，學習歷史，政治家可以更好地治國，我們老百姓最起碼可以做個明白人。」

任志強更感言：「也許是年齡與時代的原因，我讀《南渡北歸》第三部更有味道，欲哭無淚。當「南渡殘生夢獨多」和「北歸殘夢終成空」時，歷史還原了真相。同為天涯兩岸的民族各自走了一條不同的路，卻隔不斷血脈相連的相思之情。」

回望歷史，有時如夢一般，真實與假設難辨真偽，清晰與模糊交替出現。

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