細胞存活率提高7倍！更精準的CRISPR誕生了

▎葯明康德/報道

使用CRISPR基因編輯技術對DNA進行編輯時常被喻為用剪刀對新聞稿進行剪貼。然而，剪貼詞句相對容易，刪除單個字元或者立即了解剪貼對文字意思的影響卻十分困難。科學家們希望能夠運用CRISPR技術將DNA中致病的基因變異切除，並替換成正常的DNA序列。為了達成這一目標，CRISPR技術的精確性仍然需要得到提高。

▲CRISPR技術常被喻為「基因剪刀」（圖片來源：123RF.com）

日前，由斯坦福大學(Stanford University)和美國國家標準與技術研究院(NIST)聯合構建的生物計量學聯合倡議(JIMB)組織的研究人員開發出一種名為MAGESTIC的下一代CRISPR技術平台。這一平台將CRISPR技術從粗糙的剪貼工具，變為高級的文字處理器，利用類似「查詢」與「替換」的功能對遺傳物質進行精確編輯。這一成果發表在《Nature Biotechnology》上。

使用CRISPR技術對基因組進行編輯需要精確完成以下幾個步驟：1.在細胞DNA的特定位點進行剪切；2.在切開的位點準確引入需要加入基因組的序列；3.準確觀察到基因編輯產生的後果。目前的CRISPR技術使用指導RNA(guide RNA，gRNA)引導對DNA序列的精確剪切，供體DNA(donor DNA)幫助將需要加入特定位點的DNA序列引入基因組。

目前，gRNA能夠引導對基因組中特定位點的精確剪切，但是下一步的DNA修補過程往往不夠精確，很多時候修補過程會引入隨機突變，而人工表達的供體DNA序列不能有效地整合到基因組中，這導致大量細胞在基因編輯過程中死亡。對於細胞來說，讓DNA修復機制在包含上百萬到上億個鹼基對的DNA序列中找到合適的供體DNA是一件很有挑戰性的工作。MAGESTIC平台在這方面的進步是使用了名為「主動供體募集（active donor recruitment）」的手段，將人工合成的供體DNA片段募集到剪切位點的周圍。這一募集手段讓細胞存活率提高了七倍！

▲MAGESTIC平台以新的方式使用細胞條形碼，為CRISPR基因編輯增加了新的精度級別（圖片來源：Kelly Irvine/NIST）

MAGESTIC與以往高通量CRISPR基因編輯技術的另一個顯著區別在於，細胞條形碼的設計。過去，研究人員通常用質粒(plasmid)來表達gRNA，並存儲條形碼序列以追蹤細胞的突變，這些質粒DNA會隨著細胞的生長和分裂進行複製，並傳遞到下一代細胞中。但是，每個細胞中質粒DNA的數量可以從10個到40個不等，這會導致條形碼的數量無法用來精確檢測細胞的數目。新的MAGESTIC技術平台能將條形碼整合到細胞的染色體中，這一改進讓條形碼的數目變得穩定，使它們可以更精確地預測細胞的數量。

雖然在過去20年里，對DNA的測序和編輯技術出現了大幅度的進展，但是科學家們對基因組中存在的自然變異的功能和它們對疾病的影響仍然缺乏了解。MAGESTIC可以通過精確地編輯每一個自然發生的基因變異，並且把它們和其它基因變異進行比較來增進對自然變異的理解。MAGESTIC的另一個優勢是能夠在一個試管里對上百萬個細胞進行高通量基因編輯，而過去的技術平台需要不同實驗來對每個基因變異進行編輯。

「現有的技術進步讓我們不但能夠對基因組的每個鹼基對進行測序，而且能夠對它們進行修改。但是我們仍然需要更好地理解修改的後果，」這篇論文的資深作者、斯坦福大學遺傳學教授Lars Steinmetz博士說：「MAGESTIC平台好比讓我們在基因組這本書中對單個字元進行修改，然後觀察這種修改對文字意思的影響。而我們的供體募集手段讓需要添加的新信息被精確放置到剪切出現的那一頁中。」

參考資料：

[1] Taking CRISPR from clipping scissors to word processor

[2] Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast

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