來自星星的MeCP2 KO小鼠模型助力孤獨症研究

MeCP2是神經發育的重要基因。MeCP2突變或倍增會導致嚴重的神經發育障礙，如Rett綜合征（RTT）和孤獨症譜系障礙（ASD）。

由於MeCP2基因與RTT以及ASD的直接聯繫，可建立包括基因敲除（KO），致病突變敲入（KI）和人MECP2轉基因（TG）在內的多種小鼠模型來模擬相關疾病的各種癥狀，如癲癇、運動缺陷、學習和記憶缺陷、社交障礙以及焦慮等等。

南模生物自主研發的Mecp2基因敲除（Mecp2-KO）小鼠模型，可用於研究MECP2的生理功能、MECP2基因有關的自閉症與瑞特綜合征的分子機制和干預治療。目前活體供應哦！

圖1. MeCP2在體內的表達量就像一座天平，必須保持精妙的平衡，表達過多或過少，都會導致神經突觸及神經系統功能異常。

什麼是Rett綜合征

Rett綜合征是一種嚴重影響兒童精神運動發育的疾病，發病率為1/10000～1/15000，主要發生在女孩身上。6個月到18個月內開始出現癥狀，逐步喪失語言和行動能力，表現出運動失常、癲癇、呼吸系統障礙、自閉癥狀、手部刻板行為，患有這種疾病的大多數患者都會有多種嚴重的殘疾，並且一生都依賴他人的照顧。約96%的Rett綜合征病人Mecp2基因發生突變。

MeCP2的分子與細胞機制

MeCP2蛋白屬於甲基化CpG島結合蛋白的一種(Methylated CpG binding Protein)，在細胞核內發揮了多種作用（圖2），包括：轉錄阻遏物、microRNA處理器、RNA剪接調節器等。

MeCP2蛋白是一個轉錄抑制因子，其具有轉錄抑制活性是歸因於其募集組蛋白脫乙醯酶複合物的能力，還與核受體共阻遏物（NCoR）複合物直接相互作用。 MeCP2蛋白第308位蘇氨酸的活性依賴性磷酸化使其能與NCoR複合物結合，帶有T308A突變的小鼠MeCP2蛋白無法正常磷酸化，從而表現出癲癇和重複行為。

SUMO化（類泛素化）對MeCP2在神經系統中的功能具有關鍵作用。在MeCP2蛋白的K223位點上的SUMO化對於其與HDAC1複合物的結合至關重要，進一步影響突觸功能。而MeCP2蛋白K412位點的SUMO化直接關係到MeCP2的DNA結合活性。而且，Rett綜合征（RTT）相關突變顯著影響MeCP2的整體SUMO化水平，表明SUMO化在MeCP2在腦中的生理功能中起關鍵作用。

Mecp2 KO和MECP2 TG小鼠與WT小鼠相比，Mecp2 KO小鼠中下調的基因更多，包括第一個被鑒定出來MECP2基因的下游靶點——編碼腦源性神經營養因子的BDNF基因；而在MECP2 TG小鼠中，有更多的基因表達上調。這表明，MeCP2蛋白可能能夠通過轉錄機制上調基因表達。有研究表明MeCP2蛋白可以直接與DGCR8（DGCR8是細胞核內microRNA處理複合物的關鍵組分）相互作用，然後通過MECP2蛋白第80位絲氨酸的鈣依賴性去磷酸化來抑制microRNA加工。MeCP2對microRNA加工的調控具有劑量效應，因此神經發育過程中microRNA的失調也可能導致RTT和ASD病理改變。

圖2. Multiple functions of the MeCP2 protein. MBD: methyl-CpG binding domain. TRD: transcriptional repression domain. CTD: C-terminal domain. Various post-translational modifications are indicated as different color circles.

MeCP2對神經發育與可塑性的作用

海馬神經發生

MeCP2是否參與神經幹細胞的發育一直是一個有趣的問題。體外神經幹細胞研究表明，MeCP2對神經幹細胞的增殖和成熟至關重要。 對Mecp2磷酸化缺陷的S421A突變小鼠的研究顯示儘管神經祖細胞的增殖減少，但與野生型小鼠相比，Mecp2（S421A）突變使神經元分化增加。 此外，MECP2轉基因小鼠成體海馬中靜止狀態的神經幹細胞似乎是增加的，導致海馬分裂的神經祖細胞減少。 重要的是，MECP2的過表達導致海馬中小白蛋白（parvalbumin）陽性中間神經元的發育被抑制，表明抑制性迴路和海馬神經發生參與了ASD。

突觸內穩態可塑性

在Mecp2 KO和MECP2 TG小鼠中，突觸可塑性包括長時程增強（LTP）和長期抑鬱（LTD）受到影響。研究認為MeCP2的作用與穩態可塑性相關，不過MeCP2影響LTP和LTD的機制仍然有待闡明。研究人員首先發現MeCP2的表達受神經活動調控，MeCP2蛋白水平的升高繼而抑制了GluA2（編碼AMPA受體的關鍵基因）的表達。更重要的是，在Mecp2缺失的神經元中，神經元活動引發的向下突觸縮放受到影響，表明MeCP2在內穩態可塑性中的關鍵作用，而MeCP2 S421位的磷酸化對向下突觸縮放的調節至關重要。另一項研究表明，MeCP2對抑制神經活動引起的向上縮放也很重要。有趣的是，黑暗飼養視覺剝奪實驗表明，在Mecp2 KO小鼠中，視覺系統中的穩態可塑性確實被破壞了。

GABA能迴路

在大腦中，MeCP2在腦中的幾乎所有類型的細胞中都有表達，包括神經元和神經膠質細胞。 Mecp2缺失使谷氨酸能突觸的強度和數量減少；過表達MECP2，谷氨酸能突觸的強度和數量就增加。 GABA能神經元中特異性敲除MeCP2會導致小鼠嚴重的表型，包括呼吸問題並壽命縮短，表明MeCP2在GABA能系統的成熟和功能中也發揮重要作用。 在小白蛋白陽性神經元中特異性敲除Mecp2也會導致在關鍵時期突觸可塑性的缺失，表明MeCP2在神經發育中對抑制性神經網路的成熟有不可或缺的作用。

組胺能迴路

多巴胺能（Th-Cre）或5-羥色胺能神經元（Pet1-Cre）中Mecp2的缺失導致小鼠生物胺的水平明顯降低，包括多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺，多巴胺能Mecp2 KO小鼠的運動能力受損，而5-羥色胺能Mecp2 KO小鼠的攻擊行為增加。 用Dlx5/6-Cre敲除紋狀體內的Mecp2後，精神運動活動和運動技能學習也隨之受到影響；然而，紋狀體中的多巴胺水平以非細胞自主方式受到影響，這表明MeCP2對VTA紋狀體通路的正常功能至關重要。

膽鹼能迴路

MeCP2在膽鹼能神經元中的敲除會導致包括焦慮增加和社會偏好減少在內的表型。 有趣的是，研究表明，基底前腦（BF）中的膽鹼能神經元引起了這些表型，並且膽鹼能BF-海馬迴路在Mecp2膽鹼能特異性缺失後受到嚴重影響，提示海馬區中的膽鹼能調節可能對Rett綜合征的病理髮展有重要貢獻。

小鼠模型：MeCP2拯救RTT或ASD表型

神經發育障礙的特徵之一是在神經發育過程中，神經迴路的布線會發生錯誤。一旦迴路網路建成，也就是成年後，似乎就不可能再挽救這個錯誤了。然而，這一「教條」在Mecp2 KO小鼠的案例中被推翻（2006年）（圖3）。

建立Mecp2lox-Stop/y小鼠，在小鼠Mecp2基因中插入可被 Cre 剪切的 loxP-STOP-loxP 結構。這種特殊的 Mecp2 KO 小鼠，隨後可與細胞類型特異性Cre或雌激素受體融合Cre（Cre-ER）交配，通過精確的時空控制來恢復MeCP2的表達。在將Mecp2lox-Stop/y小鼠與廣泛啟動子驅動的Cre-ER小鼠雜交後，通過注射他莫昔芬，Mecp2lox-Stop/y，Cre-ER小鼠中逐漸重新開始表達MeCP2，包括運動缺陷、海馬突觸可塑性受損和壽命縮短在內的多種表型都神奇地得到了恢復。

接下來，繼續通過將膠質細胞特異性Cre小鼠（hGFAP-CreERT2）與Mecp2lox-Stop/y小鼠交配來研究MeCP2在神經膠質細胞中的貢獻，發現神經膠質細胞中MeCP2的重新表達在挽救運動障礙和呼吸問題方面表現出部分作用。 用膽鹼能特異性Cre小鼠（Chat-ires-cre）在膽鹼能神經元中重新表達MeCP2，結果運動缺陷和焦慮問題得到挽救，但社交障礙以及小鼠體重和壽命的缺陷沒有得到顯著改善。

這項出色的工作開啟了一種挽救成年期神經發育障礙缺陷的全新嘗試，同時也提出了一個有趣的假說，即神經環路在大腦成熟後仍然可能保持驚人的可塑性。

圖3. Genetic strategy for rescuing defects in Mecp2 mutant mice and transgenic monkeys. A. Genetic rescue in Mecp2 KO mice. B. Genetic rescue in MECP2 transgenic mice. C. Potential strategy applied for MECP2 transgenic monkeys.

對MECP2 TG小鼠進行基因拯救的策略也表現出可喜的結果。通過將MECP2 TG小鼠與Mecp2lox-Stop/y，Ubc-Cre-ERT2小鼠交配，在他莫昔芬處理後，MeCP2蛋白恢復至正常水平。 研究人員發現，成年小鼠（8-9周齡）MeCP2蛋白水平的恢復挽救了MECP2 TG小鼠的社交障礙和焦慮行為，這表明自閉症行為對於成人ASD患者也可能是可逆的。 對於ASD的另一強有力候選基因Shank3的類似嘗試也表明，Shank3基因在成年Shank3缺失小鼠中的基因恢復可以拯救社會缺陷和重複行為，表明自閉症缺陷在成年期通過遺傳手段修復具有可行性。

附綜述原文：Qiu Z. Deciphering MECP2-associated disorders: disrupted circuits and the hope for repair. Curr Opin Neurobiol. 2018 Feb;48:30-36.

附Mecp2-KO（NM-KO-00160）敲除策略示意圖。

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