四膜蟲的「第6種」DNA鹼基6mA
一般意義上的DNA核鹼基有4種：胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）。近幾年有人將表觀遺傳學修飾的5-甲基胞嘧啶（5mC）稱為第5種鹼基，原因在於高等真核生物中5mC的廣泛存在及其發揮的重要作用（Hattman et al., 1978）。而DNAN6-腺嘌呤甲基化 (簡稱6mA，圖1) 主要分布在原核生物中，最初報道的功能是與基因組防禦相關。
圖1 腺嘌呤甲基化形成6mA的過程
早期的研究中，6mA僅在少數幾個物種中被報道過，並且其中大部分是單細胞的纖毛蟲。因此，6mA在真核生物中分布的廣泛性受到質疑，它的功能研究在很長一段時間內被忽視。直到2015年，《Cell》雜誌同時發表三篇文章，報道了三種真核生物中6mA的存在及其在表觀遺傳調控中扮演的重要角色，引起了廣泛關注，開啟了6mA研究的熱潮 (Fu et al.,2015; Greer et al., 2015; Zhang et al., 2015)。隨後又陸續有多篇文章對一些真核生物中的6mA進行了報道 (Koziol et al., 2016; Liu et al., 2016)。這些研究工作顯示出6mA在真核生物中分布的廣泛性遠超我們的想像，並且表明6mA作為一種潛在的表觀遺傳標記，可能會成為繼5mC之後的「第6種」DNA鹼基。
四膜蟲是最早報道含有6mA的真核生物之一，並且6mA是四膜蟲中唯一的甲基化形式，不存在胞嘧啶甲基化等其它DNA甲基化形式的干擾（Gorovsky et al., 1973）。這使四膜蟲成為一個研究6mA的完美的體系。然而，四膜蟲中6mA早期研究開始於四五十年前，由於技術手段等因素的限制，四膜蟲6mA的研究只處於初步階段。因此，我們對四膜蟲6mA進行了深入的再研究，相關工作發表於2017年Nucleic Acids Research雜誌上（Wang et al., 2017）。
首先，我們利用免疫熒光染色確定了四膜蟲6mA的細胞定位，顯示其只存在於具有轉錄活性的大核中，而在轉錄沉默的小核中缺失（圖2）。
圖2 四膜蟲中6mA的細胞定位
為了解析6mA在四膜蟲全基因組分布上的精確定位，我們進行了單分子實時測序。通過分析發現，四膜蟲中6mA占其全基因組腺嘌呤的0.66%。同時，6mA的分布並不是隨機的，而是傾向分布於5′-3′ AT的序列中（圖3）。空間位置上，其又傾向分布於linker DNA處，轉錄起始位點下游，以200bp為單位呈周期性分布（圖4）。其分布的不隨機性，提示我們6mA或許在四膜蟲中發揮著至關重要的功能。
圖3 四膜蟲6mA的序列分布特徵
圖4 四膜蟲6mA的空間分布特徵
通過更加深入細緻的剖析，我們發現6mA是與核小體佔位穩定性存在顯著的正相關關係，同時與組蛋白變體H2A.Z的分布也具有密切相關（圖5）。因此6mA的分布模式，不僅是受DNA序列影響，還與染色質環境相關。
圖5 基因區6mA、核小體及H2A.Z的分布
此外，我們還發現在三種RNA聚合酶轉錄的基因中，6mA偏向性地分布於RNA聚合酶II轉錄的基因上。這就提示我們6mA可能與轉錄存在相關性。但是，我們檢測了接合生殖過程的細胞，減數分裂小核及早期的大核原基當中，轉錄活動十分活躍，沒有檢測到6mA的存在。複合性分析也顯示，6mA的含量及甲基化水平都與轉錄水平僅僅呈現弱相關關係（相關性分別為0.15和0.11，圖6）。因此，6mA與轉錄的關係可能較為複雜。
圖6 6mA的複合性分析
通過以上研究，我們發現6mA在染色質重塑及轉錄調控過程中承擔著不可或缺的角色。但是，仍有大量問題需要我們去解答。例如，何種蛋白複合體識別6mA並進行下游反應，調控甲基化及去甲基化的酶是什麼等等。為了釐清6mA的分子機制，講好6mA的故事，我們還有大量的工作要做。
參考文獻
1. Hattman, S., Kenny, C., Berger, L. and Pratt, K. (1978) Comparative study of DNA methylation in three unicellular eucaryotes. J. Bacteriol.,135, 1156-1157.
2. Fu, Y., Luo, G.-Z., Chen, K., Deng, X., Yu, M., Han, D., Hao, Z., Liu, J., Lu, X. and Doré, L.C. (2015) N6-methyldeoxyadenosine marks active transcription start sites inChlamydomonas.Cell,161, 879-892.
3. Greer, E.L., Blanco, M.A., Gu, L., Sendinc, E., Liu, J., Aristizábal-Corrales, D., Hsu, C.-H., Aravind, L., He, C. and Shi, Y. (2015) DNA methylation on N6-adenine inC. elegans.Cell,161, 868-878.
4. Zhang, G., Huang, H., Liu, D., Cheng, Y., Liu, X., Zhang, W., Yin, R., Zhang, D., Zhang, P. and Liu, J. (2015)N6-methyladenine DNA modification inDrosophila.Cell,161, 893-906.
5. Koziol, M.J., Bradshaw, C.R., Allen, G.E., Costa, A.S., Frezza, C. and Gurdon, J.B. (2016) Identification of methylated deoxyadenosines in vertebrates reveals diversity in DNA modifications. Nat. Struct. Mol. Biol.,23, 24-30.
6. Liu, J., Zhu, Y., Luo, G.-Z., Wang, X., Yue, Y., Wang, X., Zong, X., Chen, K., Yin, H. and Fu, Y. (2016) Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat. Commun.,7, 13052.
7. Gorovsky, M.A., Hattman, S. and Pleger, G.L. (1973) [6N] Methyl adenine in the nuclear DNA of a eucaryote,Tetrahymena pyriformis.J. Cell Biol.,56, 697-701.
8. Wang Y.Y., Chen X., Sheng Y., Liu Y., Gao S (2017). N6-adenine DNA methylation is associated with the linker DNA of H2A. Z-containing well-positioned nucleosomes in Pol II-transcribed genes inTetrahymena. Nucleic Acids Res.,45, 11594-11606.
作者：原生動物學研究室
2016級發育生物學博士研究生 王媛媛
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編輯：進化所宣傳組
