單細胞測序技術及其在傳染病研究領域中的應用
嚴景華，研究員。中國生物工程學會精準醫療與伴隨診斷專業委員會（籌）副主任委員。2004 年畢業於軍事醫學科學院生物工程研究所，獲理學博士學位。主要研究方向為傳染病檢測、疫苗研發及治療性抗體。共在Sci Transl Med、Cell Res、Nat Commun 等雜誌發表SCI 論文70 余篇，申請專利8 項。獲得國家科技進步獎二等獎1 項，中華預防醫學會科學技術獎一等獎1 項。
同一組織中的細胞往往被認為是具有相同狀態的功能單位，因此傳統的測序技術分析的是細胞群體的總體平均反應。然而由於細胞存在異質性，即使是來自同一細胞系或者相同細胞，由於基因組和表觀基因組的重編程（reprogramming）、DNA複製錯誤等會產生不同的基因組、轉錄組和表觀基因組。而單細胞測序技術（single-cell sequencing，SCS）可以檢測單個細胞DNA水平的單核苷酸變異（singlenucleotide variations，SNVs）、拷貝數變化（copynumber variatons，CNVs）和基因組結構的變化，還可以檢測單個細胞RNA水平的基因表達、基因融合和選擇性剪切等，以及DNA甲基化、組蛋白修飾等。近十年來，單細胞測序技術得到了迅猛的發展，已經應用在醫學、微生物學和免疫學等多個領域。本文將對單細胞測序技術的方法和應用進行總結，並對其在傳染病研究中的應用進行介紹。
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單細胞測序技術的方法
隨著測序技術的不斷創新，對細胞分子的研究逐漸從細胞群體發展到單個細胞樣本。早期使用低通量的免疫熒光、單細胞PCR（single-cell PCR）和單細胞實時PCR等技術檢測單細胞的分子標記。下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的發展為實現單細胞測序技術提供了新的可能。2009 年Tang等採用mRNA全轉錄組測序法對小鼠單個四細胞期胚胎的卵裂球轉錄組進行了單細胞水平分析。單細胞測序工作已經迅速擴展到整個基因組序列。
單細胞測序主要包括單細胞DNA測序、RNA測序和表觀基因組測序，這三種測序類型可以從不同角度揭示細胞各個階段的功能和特點。其中表觀基因組測序可以揭示DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質可及性、蛋白質-DNA相互作用和染色體的空間結構）等不同方面的基因調控。
單細胞測序主要包括以下4個步驟：單細胞分離，核酸序列擴增，基因測序和數據分析。其中單細胞分離方法和核酸序列擴增策略是實現單細胞測序的核心技術。
1.1
單細胞分離
顯微操作法（micromanipulation）是比較普遍的直視分選細胞技術，成本低廉，但是通量低，需要投入大量人力，並且容易對細胞造成機械性損傷，不利於規模化應用。而激光捕獲顯微切割技術（laser capture microdissection，LCM）可以快速獲取單個細胞，但是成本較高、通量低，並且該方法容易導致染色體片段丟失，還經常造成RNA降解。
目前常用的單細胞分離技術是熒光激活細胞分選（fl uorescence-activated cell sorting，F ACS）。該方法與前述方法不同，可以高通量、自動化地分離單個細胞，是目前應用最多的單細胞分離技術。該方法通過細胞的物理特性（如細胞大小、熒光散射度）和特異性的分子標記對靶細胞進行識別和分離。FACS法需要大量的細胞懸液，並且該方法檢測的熒光信號強度有限，因此不適用於分選低丰度的細胞。
近幾年發展的微 流控技術（microfl uidics）利用微流控晶元上的微管道進行多種單細胞分選。該方法需要的樣本量較少，試劑損耗低，細胞污染率低，可以進行規模化的推廣和應用。因此，微流控技術是目前最理想的單細胞分離方法，具有廣闊的應用前景。
1.2
核酸序列擴增
與常規的群體細胞提取的核酸不同，單個細胞所含的DNA或RNA的含量僅為皮克水平，遠遠低於任何測序技術所需的核酸量。因此通過全基因組擴增（whole-genome amplifi cation，WGA） 和全轉錄組擴增（whole-transcriptome amplifi cation，WTA），獲取高保真、無偏向性的足量DNA或RNA就成為單細胞測序的關鍵環節。
1.2.1 全基因組擴增
在NGS技術之前，單細胞基因組擴增多是基於PCR法， 如連接錨定PCR（l igation-anchored PCR，LA-PCR）、引物延伸與擴增PCR（p rimer extensionpre-amplifi cation PCR，PEP-PCR）和簡併寡核苷酸引物PCR（d egeneration oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）。這些方法都存在擴增效率低，且會產生非特異性擴增的問題。基於等溫反應的多重置換法（multiple displacement amplifi cation，MDA）是常用的全基因組擴增技術。MDA技術主要使用φ29DNA聚合酶，在恆溫下對DNA進行高效的指數擴增，獲得高保真、均一完整的全基因組序列。但是MDA技術會產生顯著的非特異性擴增。而多重退火環狀循環擴增法（multiple annealing and looping-basedamplifi cation cycles，MALBAC）則採用線性擴增方式，可獲得一致性好、偏倚少的全基因組DNA，顯著提高單細胞測序的精確度。MALBAC的擴增效率相對MDA較低，也會產生較高的假陽性率。
Stepanauskas等提出了一種組合MDA和FACS並改進的方法，即WGA-X。該方法增強了單個微生物細胞和病毒顆粒的基因組回收效率，同時保持了易用性和可擴展性，因此可以從未培養的微生物細胞和環境樣品中的病毒顆粒中獲得基因組序列和細胞大小信息。
1.2.2 全轉錄組擴增
單細胞轉錄組擴增的方法主要有唐 氏法（Tang』smethod）、Smart-seq、Smart-seq2、Quarz-seq、線性擴法（c ell expression by liner amplification and sequencing，CEL-seq），單細胞標記的逆轉錄（s ingle-cell taggedreverse-transcription，STRT）和定量的單細胞RNA測序（q uantitative single-cell RNA-seq）等。其中Smart-seq 和Smart-seq2 通過模板轉換技術，能夠獲得全長的RNA，不僅可以檢測基因表達情況，還可以研究單個細胞的選擇性剪切，鑒定新的轉錄本。
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單細胞測序技術的應用
隨著單細胞測序技術的迅速發展，該技術已經被應用在多個領域，如用於研究腫瘤的發生和演變、對腫瘤臨床檢測等。利用單細胞測序技術可以定量分析實體瘤和循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）的異質性，檢測有重要作用的罕見細胞，發現克隆演變（clonal evolution）等。因此，可以利用該技術預測和監控治療效果和預後情況、監測疾病進展、檢測耐葯等，實現個體化精準醫療。例如Tirosh等利用單細胞RNA測序技術分析了4645 個轉移性黑色素瘤細胞的腫瘤內異質性、腫瘤細胞分期和腫瘤微環境等。而Lohr等從多發性骨髓瘤病人中分離到335個腫瘤細胞，利用DNA測序技術監測治療效果和基因突變。
此外，單細胞測序技術還應用在胚胎學、免疫學、微生物學等多個方面，如病原微生物檢測、傳染病診斷、宿主免疫應答、抗體篩選等等。下文將主要介紹單細胞測序技術在傳染病研究領域的應用（圖1）。
圖1 單細胞測序技術在傳染病研究領域的應用
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單細胞測序技術在傳染病研究領域的應用
利用單細胞測序技術，可以研究單細胞水平上病原微生物和宿主細胞的基因組或轉錄組。通過分析病原微生物的核酸序列，可以檢測和鑒定新的微生物物種，了解微生物的分子進化機制，研究病毒感染的動力學；而通過分析宿主細胞轉錄組，可以探討細胞異質性對病毒生命周期的影響，以及病毒引起的宿主免疫應答。
3.1
在微生物檢測進化及傳染病診斷方面的應用
單細 胞測序技術之前，由於很多微生物難以培養，科學家們無法破譯其基因組結構。微生物的單細胞測序技術可用於研究未培養微生物的代謝潛力、相互作用和進化情況，發現新的微生物物種，大大促進人類微生物組計劃的發展。利用單細胞測序技術不僅可以檢測未知的病原微生物，還可以監測到耐葯株的出現，跟蹤病原體的抗性，從而進行傳染病的診斷。單細胞基因組學在傳染病領域得到了廣泛的應用，如單個細胞中的病毒感染動力學，病原體的抗性和傳播跟蹤，靶向或非靶向的病原基因組的恢復，致病新病原菌鑒定等。
鑒於細胞異質性的存在，在單細胞水平上理解病毒的遺傳結構是至關重要的。Combe等對水泡性口炎病毒感染的90個單細胞的881個病毒斑進行測序，發現單個感染單元內存在多個基因差異的病毒基因組。Guo等開發了一種基於微流控技術的高通量平台，用於分析單細胞中病毒感染的動力學。他們已研究了達千個脊髓灰質炎病毒感染的單個細胞，分析了其病毒感染的動力學，發現抗病毒藥物可以選擇性地消滅病毒種群中的成員。這促進了毒力因子的發現和特性鑒定，闡明了病毒種群逃避藥物的作用機制。Yang 等]調查了乙肝病毒感染情況，並在單細胞水平上量化了胞內病毒核酸的數量，即細胞質vRNA和vDNA，以及核共價封閉的環狀DNA（covalently-closed circular DNAs，cccDNAs）。
利用單細胞測序技術不僅可以精細化識別微生物基因組變異，進行病原微生物進化及溯源研究，還可以在單細胞水平上研究病毒感染的動力學，定義病原微生物的代謝特徵、致病潛力和耐藥性，進行疾病診斷。這有助於闡明病原微生物與宿主之間的相互作用機制，會對傳染病防控和人類健康領域帶來重要影響。
3.2
在宿主免疫應答方面的應用
宿主對病原微生物的免疫應答研究通常是針對群體細胞。然而，這種群體細胞研究難以區分大細胞群體的弱反應和小細胞群體的強反應；即使同源細胞也存在功能上的異質性。單細胞測序技術可以獲得宿主應答的內在異質性，精準評估免疫細胞被激活的分子機制。目前單細胞測序技術已經應用在鑒定罕見的T細胞，分析細胞黏附分子，研究固有淋巴細胞的異質性，篩選中和性抗體等。Holt等利用單細胞測序技術鑒定了罕見的CD4陽性的T細胞。Yu 等利用單細胞RNA測序技術對小鼠骨髓祖細胞進行分析，發現了固有淋巴細胞ILC2發育早期的免疫檢查點PD-1hiIL-25Rhi，從新的角度剖析PD-1和PD-L1在免疫治療中的作用。Tanaka等[33]針對人類T淋巴細胞白血病病毒1 型（human T-celllymphotropic virus type 1，HTLV-1）特異的CTL細胞的T細胞受體庫進行單細胞測序，發現移植前後骨髓和外周血CTL細胞的寡克隆多樣性受到高度限制。
3.3
在抗體篩選中的應用
目前大規模篩選抗體的方法主要是通過噬菌體、酵母等抗體文庫。所獲取的抗體存在一定的弊端：抗體是重鏈和輕鏈的隨機配對，掩蓋了自然的體液免疫反應；需要進行大量的實驗；篩選出的中和抗體往往只具有有限的中和功能。
而單細胞測序技術給抗體篩選帶來了重大變革。利用該技術可以從病人外周血淋巴細胞中獲得抗原特異性的單個記憶性B細胞，並針對單個細胞的抗體的重鏈 和輕鏈進行RT-PCR，從而獲得人源的單克隆抗體。單個 B細胞測序技術可以快速、高效地分離鑒定出抗原特異性的中和抗體，具有廣闊的應用前景。
目前，利用單個B細胞測序技術已經篩選和鑒定出多種病毒的中和抗體。Scheid等利用FACS法從感染艾滋病毒的患者中分離到對HIV抗原有親和力的記憶性B細胞，並從中篩選到大量的HIV-1特異性的中和抗體。Tsioris等通過單細胞測序技術從人B細胞中鑒定出針對西尼羅河病毒的中和抗體。Wang等從中國寨卡康復病人體內鑒定出高效、特異的寨卡病毒單克隆抗體。該抗體能在小鼠模型上有效治療寨卡病毒感染，有望成為治療寨卡病毒感染的候選藥物。類似地，Cox 等從人抗原特異性記憶B細胞中篩選到登革病毒的中和抗體。
4
小結與展望
單細胞測序技術的出現是生物學領域的一個里程碑。經過近幾年的發展，該技術已經大量應用在腫瘤研究、臨床檢測、免疫應答、抗體篩選和微生物鑒定等各個領域。該技術不僅可以對未培養的病原微生物直接測序，還可以快速、高效地篩選出抗原特異的人源中和抗體，以應對新發和突發的傳染性疾病。
但是該技術仍處在不斷完善和發展的階段，還存在以下方面亟需改進：①在前期細胞樣本的採集和保存階段，務必要保證細胞樣本新鮮，或者加入有效的保護劑；②單細胞分選時還可能存在細胞交叉污染、細胞損傷等問題，期望未來微流控晶元技術能夠不斷改進，大大提高單細胞分選的效率；③DNA或RNA擴增中仍然存在擴增失敗，或者產生很多非特異性產物情況，需要嚴格控制實驗條件，同時也期待擴增技術的不斷改進。此外，使用單細胞測序技術的成本仍然很高，影響了其在臨床檢測的應用和推廣。
隨著單細胞多組學測序技術（single-cell multiomicssequencing）的發展，未來有望利用該技術在單細胞水平進行基因組、轉錄組、表觀基因組和蛋白質組等多種組學的綜合研究，從而更加系統全面地分析單個細胞、細菌或病毒的功能，進而實現精準醫療，加強傳染病防控。
全文刊登於《生物產業技術》2018年第2期
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