單克隆抗體結構確證研究知識點
單克隆抗體結構確證研究知識點
單克隆抗體的結構確證研究項目一般包括一級結構、高級結構、糖型、純度、電荷異質性、生物活性等。
1. 一級結構分析
蛋白質的氨基酸排列順序，稱為蛋白質的一級結構，蛋白質的一級結構是蛋白質高級結構、作用機制與其生理功能的基礎。
1.1 氨基酸序列分析
1.1.1 肽圖
肽圖分析是根據蛋白質樣品的氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶作用於特殊的肽鏈位點將蛋白質裂解成小片段，通過一定的分離檢測手段形成蛋白質一級結構的特徵性指紋圖譜。
例如，胰蛋白酶（Trypsin）能特異性地作用於肽鏈賴氨酸（K）或精氨酸（R）羧基端；糜蛋白酶能水解苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。
1.1.2 序列覆蓋度
不同的蛋白質內切酶作用於不同的氨基酸殘基末端，形成不同長度的多肽分子。對於序列覆蓋度的檢測一般會採用多種酶解聯合使用的策略，以提高質譜儀對肽段覆蓋率的檢測。
1.2 翻譯後修飾
為防止經DTT（二硫蘇糖醇）還原的二硫鍵再氧化，會用碘乙醯胺對半胱氨酸（C）進行封閉，形成醯甲基化修飾。
抗體蛋白的N-端谷氨醯胺（Gln）較易發生環化生成焦谷氨酸。N-端谷氨醯胺環化是蛋白藥品的常見現象，不影響生物學活性和免疫安全性。
抗體蛋白在細胞培養過程受內源性羧肽酶的水解作用產生C-末端賴氨酸突變體，是一種非常常見的現象，不會影響抗體的相關生物學活性，但通過監視C-末端賴氨酸異質體的程度，可反映批次間產品的一致性。
一般發生N-糖基化位點修飾的位點，都有保守的氨基酸結構骨架：NXS或NXT，其中X為除脯氨酸外的任意氨基酸。
重組蛋白質的一個最普通的結構修飾就是其結構中的天冬醯胺酸殘基的脫醯胺基化。脫醯胺修飾使單抗分子的負電荷增加導致pI值降低，形成酸性異質體。
氧化是另一種常見的翻譯後修飾，主要發生在甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸和色氨酸。在人IgG1中，甲硫氨酸（Met）氧化形成亞碸是最為常見的，主要在Fc區CH2 Domain。甲硫氨酸亞碸相較於甲硫氨酸，極性增大，彎曲性下降，影響抗體構象。氧化並不會改變蛋白分子的凈電荷，對於CEX的影響視情況而定。
1.3 分子量質譜分析
分子量質譜分析分為兩部分，包括完整蛋白分子量檢測和還原蛋白分子量檢測。完整蛋白分子量檢測可以確證蛋白分子量與理論分子量的一致性。還原蛋白分子量檢測可以確證蛋白的輕鏈、重鏈分子量與理論輕鏈、重鏈分子量的一致性。分子量鑒定同時可以確定樣品的可能糖鏈及其相關分布，和其他分子量相差較多的翻譯後修飾和碎片，是一級結構研究的重要補充。
1.4 二硫鍵分析
二硫鍵（S-S）是連接不同肽鏈或同一肽鏈的不同部分的化學鍵。它由含硫氨基酸形成，半胱氨酸（C）被氧化成胱氨酸時即形成二硫鍵，二硫鍵是比較穩定的共價鍵，在蛋白質分子中，起著穩定肽鏈空間結構的作用。它是二硫鍵數目越多，蛋白質分子對抗外界因素影響的穩定性就愈大。
1.5 遊離巰基分析
巰基存在於蛋白質中的半胱氨酸、谷胱甘肽等自由殘基中，兩個巰基氧化後可形成二硫鍵，並參與蛋白質三級或四級結構的形成，對蛋白質生物活性的發揮起著重要的作用。未形成二硫鍵的遊離巰基在蛋白質分子內或分子間有可能會氧化形成非天然的二硫鍵，造成蛋白質摺疊錯誤，從而影響蛋白質的活性和穩定性；分子間的二硫鍵則有可能造成蛋白質的聚集甚至沉降，影響其穩定性。
遊離巰基含量的測定可以反映氨基酸序列中的半胱氨酸是否全部處於氧化狀態（二硫鍵形式），可以判斷出蛋白質分子的二硫鍵成鍵對數，也可以幫助判斷蛋白質的穩定性。
2. 高級結構
2.1 示差掃描量熱法分析（DSC）
示差掃描量熱法（DSC）主要通過在可控的升溫或降溫過程檢測生物分子中的熱量變化來探測樣品的熱穩定性。通過加熱，蛋白樣品的摺疊態展開會吸收熱量，而消除樣品池溫差所需的補充能量則通過設備記錄下來，這些記錄在熱譜圖上形成一個峰形，其中50%蛋白質樣品發生去摺疊時所對應的峰頂溫度作為熔融溫度Tm。Tm是蛋白熱穩定性的一個重要指示，Tm越高，蛋白的穩定性越好。
2.2 圓二色譜（CD）
利用蛋白質的圓二色性及不對稱分子對左右圓偏振光吸收的不同來進行結構分析，以分析蛋白質、多肽樣品的二級結構和三級結構。
圓二色譜在遠紫外區的掃描圖譜反映的是蛋白質肽鍵的排布信息即二級結構信息，計算所得的是蛋白質二級結構比例，即α-螺旋、β-摺疊、轉角和不規則捲曲的比例。
圓二色譜在近紫外區的掃描圖譜反映的是蛋白質側鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環境的變化即三級結構信息。
分別從遠紫外區和近紫外區解析蛋白質的二級和三級結構從而實現對樣品高級結構的一致性分析。
2.3 熒光光譜（FLR）
單抗蛋白中含有的氨基酸，如色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe），是少數能發射熒光的氨基酸，其中主要是色氨酸（Try），這類氨基酸在抗體的高級結構發生改變時（包括相對位置和微環境的改變），都會引起熒光強度或最大發射波長的改變，因此可以使用熒光光譜（FLR）測定抗體高級結構的改變。
2.4 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）
傅立葉變換紅外光譜（FTIR）是一種獲得分子振動態的信息的吸收光譜。蛋白質的紅外光譜由許多由不同官能團引起的振動帶組成，如N-H、C=O等。蛋白質中的醯胺基團會產生許多特徵IR譜帶，可用於分析蛋白質主鏈構象和二級結構。
3. 純度
抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，具有質量不均一的特點，即「異質性」。抗體蛋白分子由於聚合或者降解，會造成與產品相關的分子量大小不一的雜質存在。
SEC-HPLC：可以在不破壞蛋白高級結構的基礎上對蛋白分子的大小進行分離，能夠較好地區分單抗的聚體和單體，主要反映生理狀態下的分子大小分布。
CE-SDS：由於樣品處理過程中加入了陰離子去污劑SDS，會斷裂樣品分子內和分子間的非共價鍵，使分子去摺疊，破壞蛋白分子的高級結構，檢測變性條件下分子大小分布，對於單抗低分子量片段有著更高的解析度，在分析中加入標準物質可以確定出峰位置的分子量，可用於深入研究樣品中碎片信息及非糖基化情況。
CEX：不同的電荷異質體與陽離子交換色譜柱的結合強度不同，通過流動相中陽離子的競爭性結合使得不同的電荷異質體得到分離。陽離子交換色譜（CEX）根據分析物所帶表面電荷數的差異測定抗體蛋白的電荷異質性。
4. 生物學活性
關於生物學活性，記住下面的這個圖就行。
（http://www.360doc.com/content/18/0329/14/206294_741248372.shtml）
5. 電荷異質性
5.1 羧肽酶B（CpB）剪切前後電荷異質性研究
翻譯後修飾的不一致（脫醯胺、重鏈C-端賴氨酸剪切等）會造成多種電荷異質體的產生，電荷異質性一般會導致單克隆抗體形成比較複雜的圖譜。
C-端賴氨酸是單克隆抗體在發酵過程中的常見修飾，在人體中會被血液中的鹼性羧肽酶快速剪切而丟失，因此C-端賴氨酸不會影響單克隆抗體的活性和安全性。羧肽酶B（CpB）是一種專一用於蛋白質C-末端鹼性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）水解的鹼性羧肽酶。
5.2 唾液酸
抗體分子中所含唾液酸主要為NANA（N-乙醯神經氨酸）和NGNA（N-羥乙醯神經氨酸），唾液酸一般連接在糖鏈末端的半乳糖上。
唾液酸能夠影響抗體蛋白質藥物的活性和安全性，尤其影響蛋白質藥物在人體內的半衰期。
NANA是人體內糖蛋白所含的唾液酸，而NGNA在人體中的糖蛋白上不存在，所以含有NGNA的糖蛋白在人體中具有潛在的免疫原性，應嚴格控制NGNA的含量。
IgG Fc Domain的唾液酸基團可降低鉸鏈區的柔性，其含量越高，與FcγRIIIa的結合活性就越低，從而導致ADCC越低，其與細胞表面抗原的結合活性也隨之降低。
唾液酸因含有一個羧基而帶有負電荷，因此唾液酸還會造成糖蛋白的電荷異質性（酸性組分）。唾液酸是一種酸性九碳糖，因此帶有唾液酸的糖鏈為酸性糖鏈。
6. 糖型
6.1 糖基化修飾分類
哺乳動物中蛋白質的糖基化類型主要可分為兩種：N-糖基化和O-糖基化。大多數糖蛋白質只含有一種糖基化類型。但是有些蛋白多肽同時連有N-糖鏈和O-糖鏈。
6.1.1 N-糖鏈
N-糖鏈通過與蛋白質的天冬氨酸的自由NH2基共價連接，將這種糖基化稱為N-糖基化。N-連接的糖鏈合成起始於內質網（ER），完成於高爾基體。
6.1.2 O-糖鏈
O-糖鏈與蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸的自由OH基共價連接。O-糖基化位點沒有保守序列，糖鏈也沒有固定的核心結構，組成既可是一個單糖，也可以是巨大的磺酸化多糖，因此與N-糖基化相比，O-糖基化分析會更加複雜。
6.2 知識點
糖基化是重組抗體非常重要的一種翻譯後修飾，對抗體的功能、活性和穩定性均有重要影響。
根據糖鏈是否帶有核心岩藻糖以及糖鏈末端帶有的半乳糖殘基數，可分為不含岩藻糖型（G0、G1、G2）、含岩藻糖但不含半乳糖型G0F、同時含有半乳糖和岩藻糖型（G1F、G2F）以及含高甘露糖型（Man5、Man6、Man7、Man8）。
脫糖酶PNGaseF只能切掉N-糖鏈，不能切掉O-糖鏈。
重鏈VH和輕鏈VL區，各有三個區域的氨基酸組成和排列順序高度可變的區域，這3個CDR共同組成了抗體與抗原結合位。注意是三個區域的氨基酸而不是三個氨基酸。事實上：VH的三個高變區域分別位於29-31、49-58、95-102位的氨基酸；VL的三個高變區域分別位於28-35、49-56、91-98位的氨基酸（參考：《醫學免疫學》）。
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