重大突破：circRNA的定位和核輸出機制被破解

環狀RNA（circRNA）大部分是由蛋白質編碼基因產生，並大多積累在細胞質中，但是如何控制circRNA定位或核輸出仍不清楚。circRNA詳情請點擊：circRNA的前世今生以及臨床研究思路

5月17日，美國賓夕法尼亞大學的研究人員在Genes & Development雜誌（IF＝9.413）發表題為：A length-dependent evolutionarily conserved pathway controls nuclear export of circular RNAs的研究論文。該研究使用RNAi篩選，發現了果蠅和人類的circRNA定位關鍵調節因子，確定了circRNA定位以及核輸出機制，證實成熟circRNA的長度決定了其核輸出模式。

由於circRNA對核酸外切酶的降解具有天然的抵抗力，因此其在一些細胞的累積水平比相關線性mRNA高得多。大多數circRNA功能依然未知，但有些已被證實是作為miRNA的海綿。

儘管已經報道了一些circRNA在細胞核中積累，但大多數被有效輸送到細胞質中。由於許多circRNA在包括神經元在內的非分裂細胞中表達，所以circRNA輸出細胞核的方式肯定不僅僅依賴於有絲分裂期間的核膜破裂。然而目前尚未發現circRNA主動轉運出細胞核的機制。

RNA通常與能夠通過核孔複合物的輸出受體結合，從而到達細胞質。該研究中，作者使用RNAi篩選來確定調控circRNA定位和核輸出的因子。

DexH/D-box解螺旋酶決定circRNA在細胞核的積累

在果蠅DL1細胞中circRNA的定位，來源於laccase2和dati基因的circRNA都主要定位於細胞質中，而不管它們是從其內源基因座還是表達質粒產生的。

我們推斷RNAi篩選可用於揭示控制circRNA定位的因子，並且因此使用siRNA將26種在各種類型的RNA的核輸出中已知作用的蛋白分別在DL1細胞中敲低3天。

發現DExH/D-box解旋酶Hel25E的消耗導致長度為1120nt的circdati轉錄物的核積累。該表型不是由於總circdati表達的總體變化造成的，由於Hel25E是包括熱休克因子mRNA在內的許多果蠅mRNA的核輸出所必需的，因此得出結論：circdati的有效核輸出需要線性mRNA輸出所需的一部分因子。

果蠅只有長circRNA（> 800 nt）需要Hel25E進行核輸出

實驗發現，當Hel25E被耗盡時，這個長度為490nt的circlaccase2並不會在細胞核中累積，接下來作者檢查了另外12種具有不同長度和外顯子數的circRNA的定位。成熟circRNA核中積聚與外顯子數目之間沒有相關性。 相反，核內累積的所有circRNA長度> 811nt，而所有Hel25E非依賴性轉錄物 800nt的circRNA。

為了直接測試該長度依賴性輸出模型，我們產生表達質粒，其產生來自螢火蟲螢光素酶基因的不同長度（500,700,900,1100和1677nt）的成熟circRNA。隨著circfirefly外顯子長度逐漸增加，當Hel25E被耗盡時，越來越多的轉錄物在核內累積。

這些實驗數據表明：隨著轉錄本長度的增加，果蠅circRNAs的核輸出越來越依賴於Hel25E。需要注意的是，當Hel25E被敲低後，circRNA並沒有完全保留在細胞核，所以可能存在獨立於Hel25E的circRNA核輸出模式。

BioWorld注：此處結論並不嚴謹，文中使用siRNA並不能完全敲除UAP56和URH49，因此不能說明circRNA未完全保留在細胞核是因為有其他輸出模式。感興趣的讀者可以用Cas9敲除驗證一下。

果蠅Hel25E的同系物：UAP56和URH49，控制人類circRNA的定位

內源性人類circRNA也主要定位於細胞質，人類有UAP56（DDX39B）和URH49（DDX39A）這兩個Hel25E的兩個同系物，它們是否同樣影響了circRNA定位模式呢？

此前UAP56和URH49已被證實涉及許多人類mRNA的核輸出。使用qRT-PCR來檢測14種不同長度和外顯子的內源人類circRNA的定位。

URH49敲低時，長度

UAP56敲低時，長度＞1298nt的circRNA累積在細胞核中，但其定位明顯不受UAP49消耗的影響。

對於長度在411到1099nt之間的circRNAs，調控似乎更複雜，可能是因為RNA二級結構影響了成熟circRNA的整體緊湊性。

總之，URH49和UAP56分別調節短（ 1200nt）circRNA的定位。

Hel25E同系物中四個氨基酸的變化控制了它們的circRNA長度偏好

為了確定Hel25E的關鍵調節基序，使用siRNA在DL1細胞中敲低內源性Hel25E，並通過從質粒表達突變型Hel25E的rescue實驗來挽救circRNA核定位表型。

在表達具有大大降低的ATP結合親和力（K91N）或解旋酶活性（D193E）的Hel25E突變體的細胞中，所檢測的五種長circRNA中的四種有效地輸出至細胞質。這表明Hel25E的酶功能對於長circRNA輸出而言在很大程度上是不必要的。

接下來推論，控制circRNA長度偏好的氨基酸應該在Hel25E和UAP56（其作用於長circRNAs）之間保守，但在URH49（其作用於短circRNAs）中不保守。我們確定了一個位於底物結合域和解旋酶域之間的4-氨基酸基序，它們符合以下特徵：Hel25E / UAP56中存在K-K / S-L-N基序，而URH49中存在R-S-F-S基序。

為了測試這四種氨基酸是否確實影響circRNA長度偏好，我們用Hel25E/UAP56基序產生表達具有URH49基序和突變型URH49蛋白的突變型Hel25E/UAP56蛋白的質粒。從DL1細胞中去除內源Hel25E，然後轉染質粒rescue。

與預期一致，野生型Hel25E或UAP56顯著挽救了多個長circRNA，的核積累，但野生型URH49沒有。突變URH49以使其含有Hel25E/UAP56基序足以使其挽救長circRNA核輸出缺陷。同樣，突變Hel25E或UAP56，使它們含有URH49基序，導致其不再挽救長circRNA的核積累。

這些數據清楚地表明，不同的4-氨基酸基序對於決定Hel25E同系物的circRNA長度偏好是必需和足夠的。

總的來說，儘管circRNA具有不同的長度、序列和結構，但這項研究證明這些轉錄物通過進化保守因子衡量成熟circRNA的長度來進入特定的核輸出途徑。

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