CRISPR的研究進展及其在免疫疾病治療中的應用

如果細數近幾年最熱門的生物技術，CRISPR 一定名列前茅。

2013年，CRISPR/Cas9基因組編輯技術被《科學》雜誌列為年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR/Cas 技術作為一種 RNA 導向的 DNA 識別及編輯技術，為更高效的開展修飾提供了全新的平台，受到眾多科學家的追捧。

最新消息稱 CRISPR 技術領軍人物張峰（Feng Zhang）和 David Liu 共同創立的 Beam Therapeutics 公司正式啟航，其 A 輪融資高達 8700 萬美元。同時 Beam Therapeutics 也是首個依據 CRISPR 單鹼基編輯技術研發全新療法的公司。

這種種跡象都表明了 CRISPR 技術處於蓬勃發展階段。本文將為大家介紹關於 CRISPR 的熱點話題，包括其在免疫疾病治療中的應用，同時也將涉及當前 CRISPR 技術的缺陷。

Beam CEO John Evans and the firm』s three cofounders, David Liu, Keith Joung, and Feng Zhang.

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基因編輯技術簡介

基因編輯技術就像一把剪刀，讓人類能夠對特定基因片段進行「編輯」，從而實現對特定基因片段的敲除或者加入等。

在眾多基因組定點編輯技術中，以 ZFN（Zinc Finger Nuclease，鋅指核糖核酸酶）, TALEN（Transcription activator-like effector nuclease，轉錄激活因子樣效應物核酸酶）和 CRIPSR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9）最為常用。

ZFN（鋅指核糖核酸酶）：由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。DNA 識別域由 3-4 個鋅指蛋白串聯組成，每個鋅指蛋白特異性識別並結合三個連續的鹼基。鋅指蛋白組特異性很高，但同時也提高了構建鋅指蛋白的難度，同時 ZFN 的脫靶現象可能導致非預期突變，甚至細胞死亡。

TALEN（轉錄激活因子樣效應物核酸酶）：同樣由 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。作為第二代基因編輯技術，TALEN 大大降低的脫靶現象，並且特異性更高。但仍具有一定細胞毒性，而且模塊組裝過程有一定難度。

CRIPSR/Cas9: 由於前兩代技術的缺陷，CRIPSR/Cas9 的出現極大的吸引了大家的目光。CRISPR/Cas9 是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦，可用來對抗相同或相似病毒及外源 DNA 的再次入侵。做為基因編輯技術面世以來，CRISPR/Cas9 以其操作簡單，設計和構建速度快和低成本等特點迅速被廣泛使用，但其脫靶現象依然存在。如表一所示，三代基因編輯技術各有優缺點。

表一 ZFN，TALEN 和 CRIPSR/Cas9 對比

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CRIPSR/Cas9 基因編輯技術存在的問題

雖然相較於第一代和第二代基因編輯技術，CRIPSR/Cas9 基因編輯技術操作更加簡單，但其仍有一些難題需要攻克。

首先，CRIPSR/Cas9 編輯的靶點 DNA 在 3』 端需要有一個 protospacer adjacent motif（PAM）序列，CRISPR 靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是 RNA 嵌合體和靶 DNA 之間的鹼基配對，另一部分就是 Cas9 蛋白和 PAM 序列。

其次就是 CRIPSR/Cas9 的脫靶問題。

第三，Cas9 作為外源蛋白，如果用於治療人類疾病，人體的免疫系統是否會對其有排斥作用仍未可知。作為現在的一項「明星」技術，其應用前景非常廣泛，如果其脫靶問題不能得到有效的解決，必然會對其應用造成極大影響。

眾多研究者也從各方面著手來解決此問題，其中使用突變型的 Cas9（D10A）能夠在一定程度上降低脫靶概率。突變型 Cas9（Cas9n）只切割 DNA 的一條鏈，而非雙鏈切割，所以其需要兩條 RNA 鏈同時結合到目標 DNA 片段才會導致雙鏈切割，從而降低降低脫靶概率（圖一）[1]。

圖一：野生型（A）和突變型（B）Cas9的作用機理［1］

2017 年 5 月 30 日，來自斯坦福大學、哥倫比亞大學、愛荷華州立大學等研究機構的研究者們在《自然－方法》雜誌上面的發表一篇題目為「Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo」的文章，通過對比 CRISPR/Cas9 基因編輯過的小鼠和為編輯過的小鼠，研究者們得出結論說 CRISPR/Cas9 基因編輯會對小鼠的基因組造成非預期的基因突變[2]。

此文一出，一石擊起千層浪，僅在文章在線發表的同日，各大基因編輯相關公司的股票應聲下跌，其中 Editas Meicine, CRISPR Therapeutics 和 Intellia Therapeutics 公司的股票分別下跌 15.7%，6.9% 和 14.9%[4]。

除此之外，此項研究還吸引了眾多同領域專家的關注，最終大家發現此項研究有不嚴謹的地方，最主要的一點就是此項研究所使用的是近親繁殖的小鼠而非兄弟姐妹（即便是親兄弟姐妹，其基因組本身可能也存在很多的突變），這就導致了 CRISPR 處理組和對照組之前不確切的遺傳背景。而且實驗人員沒有對 CRISPR 處理組小鼠的親代進行全基因組測序，其最終結論的可信度也大打折扣。

最終《自然－方法》雜誌於 2018 年 3 月 30 日在線撤稿本文，同時發表 5 篇經過同行評議的通訊文章對此決定做出回應。至此，儘管此項研究的文章已經正式撤稿，但並不意味著 CRISPR 基因編輯技術就已經百分之百安全，我們仍需大量的實驗和理論在論證這一「明星」技術的的安全性。

除此之外，近期的研究表明，含有 5"-三磷酸（5"ppp）部分的引導 RNA 轉染到人宮頸癌細胞（HeLa）和小鼠胚胎成纖維細胞中能夠激活 I 型干擾素的表達，並導致大約 80% 的細胞死亡。同時作者指出，體外用磷酸酶處理引導 RNA 能夠去除 5"ppp 從而轉變為 5』 羥基引導 RNA。5』 羥基引導 RNA 與 Cas9 或者 Cpf1 轉染入人CD4+T細胞後能夠避免天然免疫同時能達到 95% 的靶向編輯效率[3]。

另外，美國斯坦福大學 Matthew Porteus 的研究團隊在生物學預印網站（BioRxiv）發表的文章顯示，分別有 79% 的志願者血液中有針對金黃色葡萄球菌（S. aureus）和化膿性鏈球菌（S. pyogenes）源 Cas9 蛋白的抗體，同時 46% 的志願者血液顯示出對於金黃色葡萄球菌源 Cas9 蛋白的抗原特異性 T 細胞免疫反應［5］。由此可見，人體的免疫系統可能會對 CRISPR/Cas9 有排斥作用，這也將是 CRIPSR/Cas9 技術用於臨床治療需要攻克的一個問題。

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CRIPSR/Cas9 技術的專利之爭

作為一項顛覆性技術，對於 CRISPR/Cas9 技術專利的爭取必然也引人注目。

早在 2012 年來自美國加州大學伯克利分校的研究者 Jennifer Doudna 及瑞典于默奧大學的研究者 Emmanuelle Charpentier 就聯合提出專利申請，然而緊隨其後的張鋒卻於 2014 年 4 月第一個拿到了專利授權，這決定也引發的接下來漫長的專利爭奪之戰。

最終，美國專利審判與上訴委員會（Patent Trial and appeal Board, PTAB）於 2017 年 2 月 16 日判定張鋒（Feng Zhang）及布羅德研究所可以繼續保留其 2014 年獲批的 CRISPR 專利權。

雖然張峰團隊的專利在美國處於領先，歐洲戰場確實另一翻模樣。2018 年 1 月，歐洲專利局駁回了布羅德研究的專利申請，並於一月之後授予Charpentier 和 Doudna 團隊關於 CRISPR/Cas9 應用的專利（EP3241902B1）［6］。

如此激烈的專利之爭也反映出 CRISPR/Cas9 技術廣闊的應用前景，相信這場戰爭還遠沒有結束。

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CRIPSR/Cas9 基因編輯技術在免疫治療中應用

作為當下最熱門的技術，CRISPR/Cas9 在眾多方面都有應用潛力，例如腫瘤免疫療法，藥物篩選和研發和 HIV 治療等等。下文將針對 CRISPR/Cas9 在腫瘤免疫療法方面進行簡單總結。

2017 年 8 月，美國國家癌症研究所（NCI）Nicholas Restifo 團隊在《自然》雜誌發表文章闡述如何使用 CRISPR/Cas9 篩選與免疫治療相關的重要基因［7］。

Nicholas Restifo 團隊構建了包含大概 123,000 個引導 RNA 的文庫用以篩選與CD8+T細胞功能相關的靶點，篩選出的靶點主要集中於在抗原遞呈和伽馬乾擾素信號通路中起重要作用的基因。其中，一個名為 APLNR 的基因吸引了大家的注意，多種不同癌症細胞系的研究結果均表明這個基因的多個突變都會影響到免疫療法的效果。

因此，APLNR 所參與或者影響的信號通路或許對於新型癌症免疫療法的開發有著直接的應用價值。接下來，在探究 APLNR 影響免疫療法機制的實驗中，研究者們證實 APLNR 蛋白能結合 JAK1，從而調節腫瘤對伽馬乾擾素的反應。

如果 APLNR 功能失活，則免疫療法的效果會降低。反之，過量表達 APLNR 能顯著增強腫瘤細胞對 T 細胞攻擊的敏感度，從而增強腫瘤免疫療法的效果。而這僅僅是篩選出的眾多靶點基因的其中一個，相信通過更多後續研究，研究者們或許能夠從其中發現新的腫瘤免疫治療靶點。

除此之外，還有許多研究顯示了 CRISPR/Cas9 在腫瘤免疫療法中的潛力。2017 年，美國食品藥品管理局（FDA）批准了用於癌症治療的細胞免疫療法，療法目的在於對患者自身的T細胞進行基因改造，使其能夠定向攻擊特定的腫瘤細胞。今年 2 月，Leukemia 期刊在線發表了來自美國華盛頓大學聖路易斯醫學院的研究人員利用 CRISPR 基因編輯技術對人 T 細胞進行改造的研究，使其能夠攻擊 T 細胞惡性腫瘤［8］。

除了這些理論研究，CRISPR/Cas9 在腫瘤治療上已經準備啟動臨床試驗。全球範圍內，中國率先開展臨床試驗。早在 2016 年，四川大學華西醫院腫瘤學教授盧鈾團隊開展「全球第一例」CRISPR/Cas9 人體臨床試驗，首名癌症患者接受了經 CRISPR 技術改造的 T 細胞治療，並表示治療進展得很順利。相比之下，雖然美國也早有計劃開展基因編輯人體試驗，但審核流程卻更為嚴格。

最終，2018 年 1 月英國《自然》雜誌網站、美國《麻省理工技術評論》網站消息稱，美國賓夕法尼亞大學目前正在為 CRISPR 基因編輯技術抗癌的人類臨床試驗做最後階段的準備，即將全面開展。此項目計劃針對多發性骨髓瘤，肉瘤以及黑素瘤等三種癌症共招募 18 名患者，這也是美國首次嘗試使用 CRISPR 治療癌症，此次項目的進展或將是人類治癒癌症路上的一大步。

除了癌症之外，HIV 治療也是全世界關注的熱點。多年來，研究者們從各個方面探索治療 HIV 的方法，而CRISPR/Cas9 的出現，也為 HIV 治療注入了新鮮血液。有研究表明，通過 CRISPR/Cas9 技術改造哺乳動物造血幹細胞產生 CCR5（HIV 的受體基因）突變型幹細胞，從而阻斷 HIV 病毒侵染哺乳動物細胞；而且 CRISPR/Cas9 還能夠靶向作用於 HIV 病毒，從而清除存在於哺乳動物體內的 HIV 病毒。

然而，2016 年 4 月，在線發表於 Cell Reports 的文章顯示，CRISPR/Cas9 能夠抑制 HIV 病毒在細胞內的複製，同時也有部分 HIV 病毒能夠躲過 CRISPR 的攻擊併產生更多病毒。研究者們通過 DNA 測序後發現，這些病毒在 Cas9 作用的位點發現了突變［9］。但研究者們也提出了解決這一問題的方法，或許同時對多個 HIV 重要位點進行攻擊能夠降低這些突變帶來的影響。

總體來說，CRISPR/Cas9 近幾年的發展突飛猛進，從研究到臨床治療全面開花，相信在不久的將來 CRISPR/Cas9 會給我們帶來更多驚喜！

（圖片來源於網路）

參考文獻：

1. Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 2013. 8(11): p. 2281-308.

2. Schaefer, K.A., et al., Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods, 2017. 14(6): p. 547-548.

3. Kim, S., et al., CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Res, 2018.

4.http://host.madison.com/business/investment/markets-and-stocks/here-s-why-editas-medicine-fell-as-much-as-today/article_cb89186a-0d07-5e65-b572-7bf42357b3fc.html

5. Charlesworth, C. T., Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans. BioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/243345

6. https://labiotech.eu/doudna-charpentier-crispr-patent-europe/

7. Cooper, M.L., et al., An "off-the-shelf" fratricide-resistant CAR-T for the treatment of T cell hematologic malignancies. Leukemia, 2018.

8. Xu, L., et al., CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther, 2017. 25(8): p. 1782-1789.

9. Wang, Z., et al., CRISPR/Cas9-Derived Mutations Both Inhibit HIV-1 Replication and Accelerate Viral Escape. Cell Rep, 2016. 15(3): p. 481-489.

10.https://www.nature.com/news/broad-institute-wins-bitter-battle-over-crispr-patents-1.21502

本期作者：廖翼飛

本科畢業於中國農業大學動物醫學專業，現在美國德州農工大學獸醫病理系攻讀博士學位，任美柏醫健研究員。

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