大牛《Nature》子刊發表最新CRISPR技術突破：一次分析數百個基因組突變

「我們提出了一種新方法，將sgRNA和供體模板與一個穩定且可遺傳的染色體外DNA分子（guide + donor）連接起來「

遺傳學家一直在利用包括從家鼠到單細胞釀酒酵母在內的多個模式動物，研究調控人類發育與生理的基本生物過程，以及這些生物過程在各種疾病中出現的變化。

因為調控人體這些生物過程的基因在其它物種中具有類似的功能，而且模式生物體中的基因可以隨意在實驗室中突變和刪除，所以這一概念是成立的。但是迄今為止，即使在易於操作的酵母中，基因也必須是一次刪除一個，而且這會在基因組中留下一些不需要的序列修飾。

來自哈佛大學Wyss研究所的George Church領導的一個研究組提出了一個新的基於CRISPR-Cas9的技術方法，可以解決這兩個問題。

具體來說，研究人員利用酵母開發了一種高通量方法，能夠在單個酵母細胞中同時精確改變數百種不同基因或者某個基因的多個特徵，效率達到80％至100％，這能幫助研究人員從群體中篩選出顯示特定行為的細胞，並確定啟動或抑制它們的基因改變。

這一研究成果公布在Nature Biotechnology雜誌上。

Church表示，「我們的方法不僅提供了一種比之前方法更高效，更準確的方法來完成酵母中的高通量『功能基因組學』研究，而且還可以模擬和測試酵母細胞中細微的人類基因變異與某些特徵或疾病之間的鬆散關聯，並找出哪些實際上具有相關性的。」

人類基因的突變通常不會像基因組序列那樣完整刪除，而是由小的點突變組成，也就是在DNA編碼中替換單個A，T，C或G鹼基單位，以及插入或刪除幾個基本單元。為了在不存在其它潛在干擾性變異的情況下，重新構建酵母基因組中的這種突變，研究人員利用CRISPR-Cas9，通過指導RNA（sgRNA）精確靶向DNA中的預選序列。在Cas9酶切割其靶序列後，稱為同源性定向重組（HDR）的生物過程可以利用外部提供的供體模板序列（攜帶感興趣突變）來修復基因。

「我們提出了一種新方法，將sgRNA和供體模板與一個穩定且可遺傳的染色體外DNA分子（guide + donor）連接起來，從而能夠在一個反應中構建大型變體文庫，提供多種相應的sgRNA，供體模板集中在酵母細胞上，並通過新一代測序鑒定那些刺激某些細胞行為的突變，「文章一作之一，博士後研究員Xiaoge Guo博士說。

在概念驗證性研究中，研究人員首先聚焦於編碼DNA解旋酶和修復酶SGS1的單個高保守基因。然後他們用有毒試劑破壞攜帶guide+donor文庫的酵母細胞的DNA，並對存活細胞的DNA進行測序。從中研究人員能發現影響SGS1特徵的突變，這些特徵對於修復受損的DNA至關重要，並能保證細胞的持續存活。

接下來，研究人員利用這種guide+donor方法刪除了一個了解甚少的基因家族的成員，這一基因家族編碼所謂的小開放閱讀框（smORF），smORF散布在整個基因組中。

他們分析酵母細胞在不同環境脅迫條件下的存活情況，可以將以前未知的基本功能指向特定的smORFs，從而為研究開闢了一個新的大門。

「使用這種方法，除了能找到基因和基因家族的新功能外，一個有趣的應用就在於可以研究基因組中的非編碼序列，有助於加深我們對基因調控和染色體生物學的理解，」文章另外一位作者Alejandro Chavez說。

此外，研究人員還表示，還可以將guide + donor方法應用於合成生物學，設計具有特定代謝和工業相關能力的酵母細胞，或將其轉移到病毒酵母菌株中，發現影響其傳染性質的基因和基因功能。

這項研究為CRISPR-Cas9技術的最新應用開闢了另一條途徑，即發現先前未知的細胞調節其生理學的分子機制。

原文標題

High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast

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