北化工馮越組揭示新型泛素化反應的分子機制

編者按：嗜肺軍團菌的SidE家族效應蛋白可以發生非經典的泛素化修飾，這一現象自2016年由普渡大學羅招慶教授課題組首次報道以後，隨即引發了廣泛關注，而相關的作用機理研究近期也爆髮式地相繼在Cell和Nature雜誌上被大篇幅報道。除了兩周前中科院生物物理所高璞研究組的工作之外，今天凌晨Nature同時在線刊發了三篇相關論文，而其中一篇Article是來自北京化工大學的馮越教授課題組，關於這篇文章的投稿信息，可參看文末的後記。

責編丨迦 漵

北京時間5月24日凌晨，北京軟物質科學與工程高精尖創新中心、北京化工大學生命學院馮越教授研究組在Nature在線發表了題為Structural basis of ubiquitin modification by theLegionellaeffector SdeA的研究長文（Article），報道了嗜肺軍團菌內一種新型的泛素修飾與連接酶——SdeA及其與泛素複合物的晶體結構，揭示了其修飾泛素及催化新型泛素化過程的工作機理。這是北京化工大學歷史上首篇發表在Nature、Science、Cell三大國際頂級學術期刊主刊的研究論文。

泛素化是泛素在特定酶的作用下，對底物蛋白進行特異性修飾的過程，幾乎參與一切生命活動的調控，與腫瘤、心血管等疾病的發病也密切相關【1】。常規的泛素化過程是由E1、E2、E3三個酶的級聯反應催化的，最終將泛素蛋白轉移到底物的賴氨酸殘基上【2】。然而，美國普渡大學羅招慶研究組在2016年的Nature文章中報道，嗜肺軍團菌（嗜肺軍團菌是一種條件性致病菌，引起人的以非典型性肺炎為主要癥狀的軍團菌病，該菌通過其Dot/Icm IV型分泌系統輸送超過300個效應蛋白到宿主細胞內，改變宿主的多種信號通路以構建其在宿主內的最適生長環境）中以SdeA為代表的SidE家族可以通過一種全新的、完全不同於經典泛素化的方式修飾泛素，並催化其對幾種內質網相關蛋白的泛素化過程，實現all-in-one的泛素化模式【3】。緊接著，在2016年底，Ivan Dikic研究組報道了對該反應過程的進一步研究，明確了SdeA的mART和PDE結構域經過兩步催化反應最終完成對底物的泛素化過程【4】。在該過程中，泛素第42位的精氨酸先在mART結構域的作用下被修飾成ADP核糖基化泛素。隨後，該修飾形式的泛素在PDE結構域的作用下生成磷酸核糖基化泛素，並轉移到底物或SdeA自身的絲氨酸殘基上。此外，羅招慶實驗室的另一項工作證明SidJ具有去泛素化功能以逆轉由SidE家族蛋白對底物的修飾，其活性不依賴於活性的半胱氨酸殘基【5】。

巧合的是，在Ivan Dikic組Cell文章在線發表的同一天（2016年12月1日），馮越研究組獲得了SdeA核心區231-1190區域的初步結構信息（圖1a），確認了SdeA中mART和PDE組成活性中心，C端結構域形成scaffold的基本結構組成方式（圖1b）。通過結構分析和功能實驗，馮越研究組發現，與PDE結構域自身即具備催化活性（即可以以ADP核糖基化泛素作為底物催化該新型泛素化反應）不同的是，mART結構域則需要PDE結構域的穩定作用才能維持正常的活性。在維持mART活性的結構要素中，mART結構域一段伸到PDE結構域中的loop（789-797段氨基酸）發揮了重要功能，在該文章中被命名為「Plug」 loop。隨後，馮越研究組又進一步獲得了該區段SdeA與泛素複合物、及與泛素-NADH複合物的晶體結構，從而揭示了泛素與mART結構域的結合模式。在二者結合的過程中，mART結構域的ARTT和PN loop，以及α-helical lobe均發揮了重要作用（圖1c）。而泛素分子中參與結合的則主要是其C端區域，尤其是泛素的R72和R74兩個氨基酸分別結合到mART結構域表面的兩個帶負電的凹槽中（圖1d），起到最關鍵的錨定作用。這兩個氨基酸的單突變均可使得泛素失去被SdeA的mART結構域修飾的能力。

圖一

在SdeA mART和泛素-NADH複合物結構中，最令人吃驚的一點在於，R72要比被修飾的R42更靠近活性中心（作為親核基團的R42的ε氨基N原子距離作為親電基團的NAD+中與煙醯胺基團相連的核糖C1原子之間的距離為11.7 ?）。從直觀上看，這與R42被mART修飾是相矛盾的。經過查閱文獻，馮越研究組發現部分mART蛋白的催化機制被認為是SN1反應，即煙醯胺基團會先從NAD+中脫離，使得NAD+轉變為活性中間體（oxocarbenium cation intermediate），之後發生親核攻擊反應。受此啟發，馮越研究組將複合物結構中的NADH替換成該活性中間體，並對該體系進行了分子動力學模擬。其結果顯示，R72在模擬過程中遠離了活性中心，而R42則進入活性中心並佔據了之前R72所在的位置，最終使得R42的親核基團和NAD+的親電基團之間的平均距離縮短至4.46 ?。

文章的最後部分還對SdeA的C端結構域的功能進行了研究，通過體外pull down和凝膠過濾層析實驗，馮越研究組證明了SdeA的C端結構域結合IcmS-IcmW蛋白複合物，並且其1191-1350區域可與IcmS-IcmW及DotL的C端形成四元複合物。這表明SdeA的C端結構域可能在SdeA轉移到宿主細胞的過程中發揮功能。

SdeA是目前為止世界上首個鑒定出的新型泛素連接酶，其與泛素複合物結構的解析揭示了一種全新的泛素化結構機理。由於哺乳動物也含有類似結構，同時其他細菌可能也具有類似的、尚未發現的泛素化系統，所以在未來，該研究將幫助鑒定出其它新型泛素化系統，從而豐富我們對細胞生命過程的認知；同時，嗜肺軍團菌是軍團菌肺炎這一潛在致死性肺炎的致病微生物，SdeA的結構解析也為設計針對該家族蛋白的小分子抑製劑，作為治療軍團菌肺炎的潛在抗生素奠定了重要基礎。

據悉，北京化工大學碩士研究生董亞南、穆雅娟、解永超及清華大學博士研究生張玉鵬依次為本論文的共同第一作者，馮越教授為本文的通訊作者，北京軟物質科學與工程高精尖創新中心及北京化工大學為第一完成單位。

馮越教授課題組合影

BioArt後記：馮越研究組的這篇文章是與Ivan Dikic研究組和美國康奈爾大學的Yuxin Mao研究組一起以back-to-back的形式共同向Nature投稿的（2017年9月24日投稿，2018年3月28日接收）。在這三篇文章中，馮越研究組以mART結構域為主要研究對象，而另外兩個研究組的重點則是PDE結構域。在三篇文章投到Nature四個多月後，中科院生物物理所高璞組將SidE家族的另一蛋白SidE的結構功能研究投稿到Cell雜誌，該文章也於日前發表（Cell丨高璞組揭示新型泛素化修飾的作用機制——胡榮貴、王豐點評）。值得一提的是，在這四篇文章中，馮越研究組報道的結構所包含的SidE家族蛋白的長度是最長的，同時該文章也是四篇文章中最早接收的。

Nature同期發表的Ivan Dikic研究組和Yuxin Mao研究組的研究論文

馮越教授簡介：

馮越，1985年生，遼寧錦州人，教授、博士生導師。2013年7月博士畢業於清華大學結構生物學中心，經高層次人才引進進入北京化工大學生命科學與技術學院工作，主要以蛋白質結構生物學為手段，對多酶生物分子機器及重大疾病相關蛋白質的結構與功能進行研究。共發表SCI論文23篇，其中第一作者或通訊作者論文11篇，分別發表在Nature(兩篇，第一作者和通訊作者各一篇)、Nature Plants(通訊作者)、PNAS(共同第一作者)等國際著名期刊上。作為項目負責人主持國家及省部級項目3項，其中國家自然科學基金青年項目和面上項目各一項，北京市自然科學基金項目一項。

參考文獻

1. Hershko, A., A. Ciechanover, and A. Varshavsky,Basic Medical Research Award. The ubiquitin system.Nat Med,2000.6(10): p. 1073-81.

2. Komander, D. and M. Rape,The ubiquitin code.Annu Rev Biochem, 2012.81: p. 203-29.

3. Qiu, J., et al.,Ubiquitination independent of E1 and E2 enzymes by bacterial effectors.Nature, 2016.533(7601): p. 120-4.

4. Bhogaraju, S., et al.,Phosphoribosylation of Ubiquitin Promotes Serine Ubiquitination and Impairs Conventional Ubiquitination.Cell,2016.167(6): p. 1636-1649 e13.

5、Qiu, J., Yu, K., Fei, X., Liu, Y., Nakayasu, E. S., Piehowski, P. D., ... & Luo, Z. Q. (2017). A unique deubiquitinase that deconjugates phosphoribosyl-linked protein ubiquitination.Cell research, 27(7), 865.

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