靶向BET溴結構域治療癌症

含溴結構域的外星(BET)亞家族是癌症靶向治療研究又一熱門，已發現BET抑製劑在許多臨床前癌症模型中表現出潛在的抗腫瘤作用。其中，BRD4作為研究最透徹的BET蛋白，參與c-Myc和BCL 2等細胞周期和凋亡必需基因的調節作用，與眾多血液病和實體腫瘤的發生髮展密切相關。

本期Focus onCNS由整形外科王晶晶碩士帶來——「靶向BET溴結構域的癌症治療」，帶領大家一起了解BET溴域抑製劑的最新研究進展,尋找癌症治療新的新方向。

靶向BET溴結構域治療癌症

TargetingBET bromodomains for cancer treatment

作者 | 王晶晶

文編 | 二妮兒

美編 | Springfield

蛋白質之間相互作用很難用小分子阻斷，在分子方面，很少有人關注與組蛋白乙醯化標記結合的蛋白質。因此第一批溴域抑製劑的意外識別使得這種情況發生了重大變化。最有效的抑製劑作用在溴結構域和末端外(BET)亞家族，並模仿乙醯賴氨酸結構，從而防止BET溴化結構域與乙醯化組蛋白的結合。本文評估BET溴域蛋白，因為它們代表了主要表現為癌症的不同病理傾向的目標。大量研究表明BET蛋白的選擇性抑製劑或siRNA或shRNA介導的BRD4沉默在急性髓系白血病(AML)、多發性骨髓瘤(MM)和淋巴瘤等血液系統惡性腫瘤中起著重要作用。最近，基於JQ1和I-BET762等抑製劑的影響，BET蛋白在實體腫瘤中的作用也被報道。最近，第一種BET抑製劑已進入臨床研究，針對不同癌症患者的新的治療方案有望不斷推出。

介紹一下含溴域蛋白的BET亞家族

目前共鑒定出46種不同的含溴結構域蛋白。BET亞家族由三種普遍表達的BRD4、BRD3和BRD2組成，以及睾丸特異性BRDT形式。BET蛋白各自具有兩個高度保守的溴結構域(BD1和BD2)，它們與組蛋白和其他蛋白質中的乙醯化賴氨酸結合，還有一個具有額外功能的額外末端(ET)區域(圖1)。BET蛋白具有不同的生理功能。基因組分析表明，BRD4、BRD3和BRD2的染色質結合位點有一定的重疊，但由於功能的不同存在著明顯的差異。

圖1人BET蛋白亞家族的結構域組織

本文詳細分析了BET溴結構域與乙醯化組蛋白的結合，並利用體外斑點陣列鑒定了識別基序。這揭示了個體溴域偏好和鄰近PTMs的影響之間的細微差異。BRD4、BD1的詳細突變分析基於它們對乙醯化組蛋白H4肽或BET抑製劑JQ1識別的影響能夠對相互作用的殘基進行分類。結果表明，雖然幾種氨基酸對乙醯賴氨酸和JQ1的結合有相似的影響，但其他殘基對配對識別的影響更明顯，說明不同的相互作用方式不同。

基因組分析表明BRD4的結合與H3K9、H3K27、H4K5和H4K8位點的乙醯化標記相關。有趣的是，帶有一個失去活性的BRD4等位基因的細胞降低了組蛋白乙醯化，這意味著它在維持整體染色質乙醯化水平方面發揮了作用。

1.BET與非組蛋白的相互作用

RNA-POLⅡ活性的調控

除了乙醯化組蛋白，BRD4還有幾個額外的蛋白配對(圖2)。BRD4作為JMJD6、CyclinT1/T2和CDK 9複合物的一部分，在控制暫停釋放方面發揮了重要作用。這些複合物與新建立的抗停頓促進劑相互作用，以消除H4R3二甲基化，從而釋放含有HEXIM 1和7SK snRNA的抑制複合物。BRD 4也是某些介體複合物的一部分，這意味著它在轉錄起始過程中也起著重要的作用。

圖2BRD4-相互作用因子及其對下游基因調控的影響

2.與轉錄因子的相互作用

BRD4溴結構域識別乙醯化的RERA，從而幫助穩定NF-κB並調節其轉錄活性。因此，JQ1治療降低了NF-κB靶基因（如IL-6、IL-8和CCL2）的表達，與BET抑製劑所顯示的強的抗內毒素作用相一致。最近報道了BET蛋白BRD 2、BRD 3和BRD 4與雄激素受體(AR)N端結構域的相互作用。它被一種BET抑製劑破壞，並影響對雄激素靶基因調控區域的AR識別。有趣的是，BRD3和BRD4也佔據了雌激素靶基因(ER)的調控區域，從而控制了它們的表達。因此，BET抑制具有損害ER功能的潛力，這是與治療後在乳腺癌模型中觀察到的抗增殖作用相協調的。

3.此外BET還有支持染色質組織和重塑的作用，而BET蛋白之間也有相互作用（同源二聚等）。在調控細胞增殖方面，BRD4還通過控制染色體分離過程中必不可少的參與者Aurora B的表達和調節cyclinD 1和其他G1期相關基因的表達來參與細胞周期的進展。另有研究表明其在氧化應激、DNA損傷、少突膠質細胞分化中均有作用。

BET蛋白抑製劑與癌症的關係

為體內研究提供具有適當藥物動力學特性的強效和選擇性抑製劑有助於證明BET蛋白在癌症、動脈粥樣硬化、炎症和病毒感染等多種疾病中的重要作用。最近的許多報道表明，BET抑製劑單一用藥時是有效的抗腫瘤藥物。此外，它們還可以與多種靶向癌症藥物結合，以提高腫瘤的療效。

在白血病中，利用shRNAs篩選染色質功能調控因子後，BRD4被確認為參與AML的一種必需蛋白。這一結果是通過BET抑製劑JQ1治療多個AML細胞系而得到的。有實驗表明JQ1擁有在體內阻斷AML的潛力。其抗增殖活性在其他白血病和淋巴瘤模型中也有顯示。多發性骨髓瘤中，許多MM細胞對BET抑制有反應，JQ1抑制c-Myc轉錄程序，誘導細胞周期阻滯於G1期和衰老期。淋巴瘤中，BET抑製劑治療可抑制不同來源淋巴瘤細胞株的增殖。用JQ1治療瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)模型Ly1時，體內療效顯著。許多數據表明BRD4通過識別關鍵的調控元件和間接地調節諸如c-Myc和E2F等基本轉錄因子而直接控制著基因的子集。

在實體腫瘤中，睾丸核蛋白(NUT)中線癌(NMC)是一種成功檢測BET抑製劑的實體腫瘤。這種非常罕見的鱗狀細胞癌經常攜帶BRD4或BRD3基因與NUT基因的易位。BET抑制可減少乳腺癌的生長。JQ1在抗雌激素他莫昔芬的乳腺癌模型中顯示出較強的抗腫瘤活性。BET抑製劑還可用於治療基底細胞樣乳腺癌模型SUM 1315。JQ1還可阻斷多個胰腺癌細胞株的生長。另外，BRD4在許多原發性和轉移性黑色素瘤組織中過度表達。BET抑製劑MS 417和MS 436在不同黑色素瘤細胞株中表現出抗增殖活性，進一步提示其在該腫瘤類型中的意義。另有研究表明BET抑製劑在膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤及髓母細胞瘤等神經腫瘤中也有應用。

BET抑製劑

目前常用AlphaScreen(PerkinElmer)、熒光偏振、時間分辨熒光共振能量轉移和BROMOSCANSM技術(DiscoveRx)等方法基於識別基因片段篩選出屬於BET抑製劑的藥物，本文報道了用熱位移法/差示掃描熒光法、等溫滴定量熱法、表面等離子體共振法、生物層干涉法、核磁共振法和x射線晶體學等方法研究BET抑製劑與靶材相互作用的生物物理特性。最近，如光漂白後熒光恢復法(Frap)和基於細胞的蛋白質穩定試驗等能夠驗證化合物在活細胞中的作用的試驗的出現，擴大了可用於發現和表徵BET抑製劑的技術範圍。

目前發現的BET抑製劑主要包括：（1）安定和氮雜類化合物，如三唑-噻唑-地氮平JQ1；（2）喹唑酮類，如二氫喹唑啉酮；（3）異噁唑，如喹啉二甲基異惡唑i-BET151；（4）其他結構，如I-BET 726（一種1-醯基四氫喹啉衍生物），吡啶酮和吡啶嗪酮等。

此外，人們發現有幾種激酶抑製劑與溴域有很強的相互作用(圖3)。但是，部分激酶抑製劑的抗腫瘤活性可能是由於一種額外的BET阻斷活性。這兩種活性是否都能在單一化合物中得到優化，以及未來的雙重抑製劑是否最終將證明對病人的治療是有益的還有待觀察。

臨床試驗

表1 目前有五種BET抑製劑正在進行癌症適應症的臨床試驗

一些總結

目前認為，BET蛋白主要作為調控轉錄延長的調控複合物的一部分在癌症中起著關鍵作用。BRD4在該家族中被研究的最多，它在調節c-Myc的表達方面起著主導作用，c-Myc是許多腫瘤類型中必不可少的癌基因。最近對選擇性和強效抑製劑的鑒定技術提高了我們對BET蛋白功能的認識。重要的是，這些化合物在幾種癌症模型中顯示出的有效性使得很多臨床研究得以開展（主要是在血液病患者身上）。關於BET抑製劑的最初研究發表與臨床研究中的初步正面效果之間還不到4年的時間，這一事實表明，學術界和製藥業的密切合作和共同努力能夠加速理論到成功的轉化，從而使患者受益。

未來研究前景

首先，BET抑製劑的早期臨床試驗已經產生了令人鼓舞的結果，並且很有希望在今後幾年將出現一種基於這一原則的新的癌症治療模式。在早期階段對BET抑制的獲得性耐葯還沒有被報道，但是新的技術如基因組範圍的DNA測序和比較基因表達抑制將有助於了解一旦出現耐葯腫瘤時所涉及的分子機制。聯合使用與BET抑製劑具有協同作用的藥物可能也值得進一步探討。

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