缺氧和酸中毒：免疫抑制因素及治療靶點

由於腫瘤微環境中血管生成和細胞生長的不平衡性，會出現包括缺氧和酸中毒等多種代謝相關應激反應。這些應激反應具有免疫抑制作用，可以幫助腫瘤逃避機體免疫監視。2018年，Sultan Damgaci教授在《Immunology》雜誌上發表了題為《Hypoxia and Acidosis: Immune Suppressors and Therapeutic Targets》的綜述，探討缺氧和酸中毒對腫瘤免疫的抑制作用和相應治療靶點，現介紹如下。

腫瘤組織內不僅包含腫瘤細胞，還包括基質細胞、血管生成細胞、腫瘤相關成纖維細胞和大量浸潤的炎症細胞（圖1）。腫瘤的特徵如增殖、抵抗細胞死亡、誘導血管生成、侵襲和轉移、逃避生長抑制和逃避免疫監視及攻擊等都與機體的免疫功能密切相關。腫瘤細胞可通過多種機制抑制T細胞的活化：通過調節性T細胞（Treg細胞）分泌抑制性細胞因子如IL-10和TGF-β；或通過自然殺傷（NK）細胞和CD4+T細胞分泌顆粒酶以達到細胞溶解；或者通過影響效應T細胞（Teff）的代謝，或樹突狀細胞（DC）通過CTLA-4靶向作用於T細胞。CTLA-4和PD-1在腫瘤免疫治療中作為檢查點具有重要作用，細胞毒性T細胞相關蛋白-4（CTLA-4, Cytotoxic T lymphocyte associate protein-4）是T細胞表面表達的一類共刺激分子，對免疫反應有負性調節作用。與CD28的功能類似，在T細胞激活過程中，CTLA-4能夠與APC表面的CD80/CD86特異性結合來激活下游信號。程序性死亡受體1（PD-1, programmed death 1）為CD28超家族成員，其配體是PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-L1表達上調可以抑制T細胞抗腫瘤反應。巨噬細胞分為抗炎型（M1）和促炎型（M2）兩類，經典激活的M1巨噬細胞表達CD80/CD86分子並可激活T細胞。此外，M1巨噬細胞可以殺傷致病細菌和殺死腫瘤細胞。M2巨噬細胞表達免疫抑制配體。在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞打破正常的腫瘤特異性免疫應答機制以逃避機體的免疫監視，如通過巨噬細胞亞群比例的改變，腫瘤相關巨噬細胞（TAM, tumor-associated macrophage）的形成和腫瘤細胞上的免疫抑制配體（如B7H4）的表達上調等。髓源性抑制細胞（MDSCs, Myeloid-derived suppressor cells）也具有免疫抑制功能，對T細胞和NK細胞的功能具有負性抑制作用。下面主要介紹腫瘤組織中缺氧和酸中毒對抗腫瘤免疫反應的抑制作用。

圖1. 腫瘤微環境中的細胞構成

缺氧對免疫功能的影響

結直腸癌可通過血液、淋巴或體腔種植轉移，肝臟、腹膜、肺以及骨是最常見的是轉移部位。轉移過程既受腫瘤細胞本身的生物學特性的影響，也與機體的反應密切相關。目前已有證據表明手術本身及相關併發症，以及圍術期相關因素如麻醉及鎮痛，可通過直接作用於腫瘤細胞或作用於包括免疫系統在內的腫瘤微環境來影響腫瘤的轉移。手術在切除病灶的同時也可以促進腫瘤播散，並促進術前已經發生的微小轉移的進展等。

在圍手術期通過減輕手術創傷減少術後腫瘤轉移複發是目前研究的熱點之一，但對於腫瘤手術促進術後轉移發生的人體研究目前難以實行，因為外科手術導致的應激反應十分複雜，難以單獨衡量其影響的大小，目前的數據主要來源於動物模型或從臨床數據中推測而來。圍術期許多因素可導致轉移的發生，包括麻醉藥物的使用、術後鎮痛以及輸血等。手術創傷伴隨的生理學改變如低體溫、禁食、疼痛以及心理應激亦可影響手術應激程度。其他術後併發症如感染不僅可加劇應激反應，還可導致常規在結直腸癌手術後6-8周進行的化療中斷。手術應激還可通過影細胞毒性藥物的葯代動力及跨膜運輸來影響轉移。

手術創傷的促轉移作用

腫瘤組織內缺氧是由於腫瘤細胞增殖導致需氧增加以及腫瘤血管分布不均導致局部血液供應不足。雖然腫瘤可以通過血管內皮生長因子（VEGF）信號促進血管形成，但未受調控的VEGF實際上會導致血管的過度增殖，毛細血管網分布不平衡從而導致組織灌注減少。缺氧對參與免疫反應的細胞均有顯著影響。

1.1 缺氧對淋巴細胞的影響：

淋巴細胞主要分為T細胞，B細胞和NK細胞。研究發現，與正常氧濃度相比，低氧顯著抑制淋巴細胞增殖。HIF1-α能夠調節Treg細胞與Th17細胞的分化平衡，促使腫瘤細胞和MDSC上的PD-L1表達從而抑制Teff細胞。缺氧能夠增加Treg細胞的主要調節因子FOXP3的轉錄因子水平。缺氧還促進TGF-β和CCL28的產生，兩者都能上調Treg細胞，抑制Teff細胞反應以及促進血管生成和腫瘤耐受。此外，缺氧使CD4+細胞傾向於向Th2表型分化，分泌的IL-4有促進巨噬細胞向M2型分化的作用。已有研究表明，由cAMP腺苷受體A2AR促進的胞外腺苷的聚集能夠抑制T細胞的抗腫瘤活性。

HIF1-α上調的金屬蛋白酶ADAM10和下調的MHC I類鏈相關基因A（MICA）對細胞抗NK細胞殺傷有重要作用。腫瘤細胞MICA的表達水平決定著腫瘤細胞對NK細胞殺傷的敏感性，NK細胞上的NK2D和MICA之間的相互作用在NK細胞對腫瘤細胞的應答方面起著關鍵作用。在缺氧狀態下，TGF-β的上調會降低NK細胞上的NKG2D受體。此外，缺氧誘導的自噬導致NK細胞的顆粒酶B降解使得腫瘤細胞逃逸NK細胞的殺傷作用。缺氧對降低NK活性的影響也可以是間接的。在黑色素瘤細胞中，缺氧狀態下以HIF1-α依賴的方式增加間隙連接蛋白Connexin43的表達，Connexin43使得細胞對NK細胞介導的殺傷作用敏感性降低。

1.2 缺氧對髓系細胞的影響：

巨噬細胞是腫瘤微環境中最豐富的髓系細胞之一。巨噬細胞的主要作用是吞噬和消化受損組織和外來物質，包括微生物，細胞外基質和腫瘤細胞。然而，受到腫瘤缺氧環境的影響，TAMs可通過誘導血管生成和基質重塑促進腫瘤的惡性進展。缺氧使得VEGF、成纖維細胞生長因子和基質金屬蛋白酶7和9表達增加，導致TAMs在缺氧區域浸潤增加，從而促進腫瘤進展。體內實驗已經表明在炎症微環境中，HIF1-α對於調節髓系細胞的糖酵解代謝，生長和功能而言是必需的。TAMs和MDSC通過神經氈蛋白及其受體腦信號蛋白3A結合進入缺氧區。在進入缺氧區後，HIF1-α下調腦信號蛋白3A，導致這些細胞在缺氧區積累。腺癌模型中的研究證實，TAM的M1表型在正常氧濃度狀態下佔優勢，而TAM的M2表型在低氧環境中佔主導地位。此外也檢測了在不同類型的TAM狀態下HIF活性。HIF1-α在M1極化期間穩定，HIF2-α在M2極化期間穩定。為何出現這樣的差異目前仍需要進一步研究，但是已經發現HIF2-α是精氨酸酶基因表達的重要調節因子，而精氨酸酶是M2極化的重要標誌。缺氧誘導單核巨噬細胞表達血管生成素-2受體（Tie2+）的TAMs，具有促進血管形成的作用。目前已知TAMs表達的HIF1-α也能夠抑制T細胞應答並促進MDSC上的PD-L1表達。

1.3 缺氧對中性粒細胞的影響：

中性粒細胞是人體內最主要的固有免疫細胞之一，腫瘤微環境中的中性粒細胞對腫瘤的發展起到促進的作用，浸潤性中性粒細胞產生的細胞因子和趨化因子能影響腫瘤微環境中炎症細胞的招募和激活,為腫瘤的發展提供良好的免疫抑制微環境，調控腫瘤的生長、轉移和血管生成。腫瘤的高侵襲率與缺氧誘導的中性粒細胞升高之間存在相關性。缺氧通過HIF1-α介導促進中性粒細胞的存活；而激活脯氨醯羥化酶，PHD-2和PHD-3能夠促進HIF1-α的降解。此外缺氧也會影響中性粒細胞趨化遷移。

1.4 缺氧對樹突狀細胞的影響：

樹突狀細胞(DC，Dendritic cell)是抗原呈遞細胞，在連接固有免疫和獲得性免疫方面發揮重要作用。目前研究缺氧對DC影響的研究較少。缺氧和HIF1-α能夠調節DC成熟，活化和抗原呈遞功能，缺氧通過DC調節共刺激分子CD80和CD86的表達。HIF1-α也阻礙髓樣前體細胞分化為漿細胞樣DC。

表1. 缺氧對免疫細胞的影響

酸中毒對免疫功能的影響

儘管酸中毒導致的組織低pH值在實體腫瘤中普遍存在，但是目前研究其對免疫系統影響結果較少。腫瘤酸中毒是由糖酵解代謝和灌注不足導致。有氧糖酵解是腫瘤的特徵之一，即使在氧氣供應充足的條件下，腫瘤細胞仍偏好於選擇採用有氧糖酵解方式為自身供能，而非選擇ATP生成效率更高的氧化磷酸化。有氧糖酵解導致細胞外環境的酸化，此外乳酸的釋放也有助於腫瘤細胞逃避免疫監視。乳酸是影響腫瘤酸度，局部侵襲和基質重塑的啟動子。腫瘤微環境的酸性程度與腫瘤發生有相關性，包括在腫瘤發生的最初階段腫瘤細胞的存活，逃避細胞凋亡和藥物抵抗。

2.1 酸中毒對淋巴細胞的影響：

腫瘤細胞和免疫細胞高度依賴於糖酵解途徑進行增殖、存活和保持活性。即使在有氧條件下，腫瘤細胞也依賴於糖酵解，這使得腫瘤細胞能夠比不利用糖酵解的細胞更快速地適應變化的環境。此外，糖酵解可以顯著降低葡萄糖的可用性，在沒有葡萄糖的情況下，腫瘤細胞可以進入靜止期，但活化的T細胞則不能存活。腫瘤的酸性微環境似乎對CD4+Treg細胞影響不大，可能是因為它們主要依靠脂肪酸氧化供能。與CD4+細胞相反，在人和小鼠腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞中發現酸性微環境可以誘導細胞處於失能狀態，細胞活性降低，細胞因子分泌下降，STAT5/ ERK信號的激活減弱，從而下調IL-2Ra（CD25）和TCR的表達。體外研究表明，外環境的pH值提高可以逆轉T細胞失能狀態，而長期暴露於低pH值環境可導致細胞永久性損傷或誘導T細胞凋亡。此外，腫瘤酸性環境通過抑制Th1淋巴細胞的成熟和功能來促進腫瘤進展，同時通過失活IFN-γ和抑制腫瘤壞死因子TNF-α來刺激能夠促進腫瘤進展的Th2淋巴細胞。有研究表明，通過口服緩衝液中和體內腫瘤酸度，可以增加免疫檢查點抑製劑和過繼性T細胞治療的功效。

2.2 酸中毒對髓系細胞的影響：

酸中毒對巨噬細胞作用的研究較少。一些研究側重於對腫瘤血管生成的影響，並且表明在乳腺癌中，低pH和高乳酸濃度可以刺激TAMs激活和轉化成促血管生成的表型。有研究發現腫瘤細胞產生的乳酸通過誘導VEGF和類似M2的極化而影響TAMs的信號傳導，並引起巨噬細胞中精氨酸酶1的表達以抑制T細胞增殖和活化。

2.3 酸中毒對樹突狀細胞的影響：

研究酸中毒對DC細胞的作用發現，細胞外酸度能夠改善來源於鼠骨髓的DC的抗原遞呈能力。在這項研究中，乳酸單獨或與腫瘤來源的巨噬細胞集落刺激因子及IL-6共同作用，都可以顯著改變DC的抗原遞呈能力和功能活性。

表2. 乳酸和酸中毒對免疫細胞的影響

針對缺氧和酸中毒改進免疫治療

免疫治療的主要類型包括免疫檢查點抑製劑、腫瘤疫苗和過繼性T細胞治療。雖然目前取得了重大進展，但長期有效率仍然較低。例如，抗PD-1或PD-L1抗體對黑色素瘤的客觀反應率為18％至27％，抗CTLA-4抗體為11％。儘管PD-1和CTLA-4抗體的聯合使用與單獨使用相比增加了20％至40％，但仍有60％的患者無反應。所以如何進一步改善治療效果是需要深入研究的問題。結合上述缺氧和酸中毒對免疫功能的影響，調控腫瘤的微環境可能是可以改善部分患者免疫治療結果的手段之一。

3.1 靶向低氧聯合免疫治療：

缺氧可以影響免疫檢查點受體及其配體的表達。處於缺氧狀態的細胞通過HIF1-α選擇性地上調MDSCs上的PD-L1，此外缺氧還顯著增加巨噬細胞，樹突狀細胞和腫瘤細胞上PD-L1的表達。在乳腺癌小鼠模型中，使用HIF1-α抑製劑聯合基於DC的免疫療法治療後顯示腫瘤消退，並且存活率顯著改善。另外，可以通過減少免疫抑制細胞的數量和功能，增加效應T細胞功效來增強免疫治療效果。腫瘤細胞通過產生VEGF，促血管生成素-2，IL-8和其他因子促進血管生成以適應缺氧。由於功能障礙的血管導致組織缺氧和腫瘤抵抗，所以血管正常化能大幅減少腫瘤微環境中的缺氧範圍，如通過靶向作用VEGF/VEGFR使血管正常化，以促進CTL進入腫瘤區域，還可以促進巨噬細胞極化並刺激向M1表型分化，誘導Th1並促進IFN-γ和IL-12的分泌，從而使得CTL浸潤，Treg細胞減少。Evofosfamide（TH-302）是一種選擇性低氧激活的前體藥物，靶向作用於實體瘤的缺氧區域，其在動物前列腺癌模型中發現可以改善免疫檢查點（CTLA-4, PD-1）阻斷療效。

3.2 靶向酸中毒聯合免疫治療：

在動物腫瘤模型中發現，使用緩衝液中和腫瘤酸中毒聯合免疫療法可以改善治療效果。在B16黑素瘤和Panc02胰腺癌中，通過自由口服碳酸氫鹽緩衝液（200mM）用於中和腫瘤酸度，並且與抗CTLA-4、抗PD-1或過繼T細胞療法聯合使用可帶來持久應答。然而，緩衝液療法在臨床上並不容易實施，三項臨床試驗（NCT-1350583，NCT-01198821和NCT-1846429）均由於患者的不良依從性和不良胃腸道事件而宣告失敗。另一種提高腫瘤組織pH的方法是使用脲酶。脲酶是尿素降解酶，可將尿素轉化為氨，產生的氨使得局部pH值升高。此外，可以通過影響代謝或離子轉運間接地改變腫瘤酸度。例如，碳酸酐酶IX（CA-IX）作為在細胞外表面可逆地將CO2水合成碳酸氫鹽和質子的催化劑，可以控制細胞內和細胞外酸鹼平衡，調節細胞及其周圍的環境的pH值。選擇性抑制CA-IX的小分子抑製劑成為一個潛在的抗癌靶點。

總結

目前，腫瘤治療方式主要有手術、化療、放療、免疫治療等，腫瘤的免疫治療已經被證實能夠在大量患者中產生持久效應。缺氧和腫瘤組織的酸性環境都對免疫系統有直接和間接的抑制作用，已有研究表明缺氧和低pH值可導致免疫治療的抵抗。所以深入探究缺氧和酸性pH對免疫系統的影響，有助於提高腫瘤免疫治療的療效，探索新的治療腫瘤的思路和方法。

（編譯 祁潔；審閱 繆長虹）

原始文獻：

Damgaci S, Ibrahim-Hashim A, Enriquez-Navas PM, Pilon-Thomas S, Guvenis A, Gillies RJ. Hypoxia and acidosis: immune suppressors and therapeutic targets. Immunology. 2018 Feb 27. doi: 10.1111/imm.12917. [Epub ahead of print]

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