血液遊離DNA臨床應用

遊離DNA前世今生

血液中遊離DNA（cell free DNA，cfDNA），是指外周循環血中遊離於細胞外的部分降解了的機體內源性DNA，嚴格意義上講不包括如真菌、細菌和病毒血症等血中外源性核酸。

胎兒遊離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）和腫瘤遊離DNA（cell free tumor DNA，ctDNA）在孕婦和腫瘤患者體內的發現，使無創產前篩查（NIPT）和腫瘤液體活檢（liquid biopsy）兩大技術在臨床中應用日益廣泛，且發展極其迅速。

cfDNA是複雜的混合物，包含良性細胞、白細胞和病原體的核酸，cffDNA或ctDNA只佔其中很小一部分。健康人血漿中也有少量的遊離DNA，片段主要在185~200bp或其整數倍，主要來源於細胞凋亡，相較於正常人，孕婦、腫瘤患者、器官移植患者血液中cfDNA長度較短。孕婦血漿中胎兒遊離DNA主要是胎盤、胎兒造血細胞等的細胞凋亡形成，懷孕周數越高，母體血液中所含的胎兒遊離基因片段也越多，妊娠大約7周後可以檢測到。通過母體遊離DNA檢測胎兒染色體非整倍體疾病（如21-三體，18-三體和13-三體），由於可以直接檢測到胎兒的染色體，與傳統的生物標記物相比，檢出率有很大幅度的提高，準確率可達到99%，而假陽性率低於1%，類似的還有胎兒RhD血型和Y染色體特異性序列（性別）鑒定等，新的無創產前診斷標誌物已成為臨床應用的寵兒。

血液中循環的腫瘤細胞（CTC）及轉移到骨髓或肝臟等處的腫瘤細胞也可以釋放出遊離DNA， 其大小主要分布在20~200bp，大的則可達到1000bp以上。研究表明，腫瘤患者外周血液DNA 水平不僅明顯高於正常人，且血液遊離DNA具有腫瘤組織細胞DNA一致的基因突變類型，通過血液遊離DNA基因突變的檢測，可以對相應疾病進行預警，並有利於進一步對疾病進行分型評價，如EGFR、KRAS和TP53 等基因，這些在多種類型腫瘤中具有高突變頻率的基因的檢測對腫瘤的早期診斷具有重要的臨床意義，通過血液遊離DNA基因可作為腫瘤無創檢測的新一代標誌物。

遊離DNA檢測結果---因提取而迥異

遊離DNA的檢測技術有新一代測序（NGS）、數字PCR 、ARMS-PCR、核酸質譜等，各有特點，都能用於遊離DNA分析，但此類研究的主要障礙之一在於無法有效獲取血液中微量的cfDNA，收集操作困難，丟失量大，檢驗靈敏度低，且沒有公認的標準提取和純化方法，不同實驗室採用不同的試劑或提取方案，提取結果可比性較差。目前，cfDNA主要的提取方法有硅膠柱法、酚-氯仿法和磁珠分離法等，優缺點比較如下：

專業化、大師級遊離DNA提取解決方案

達安基因遊離DNA提取方案可採用提取儀器自動化完成，也可用磁力架進行手工提取。以處理2mL樣本為例

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手工提取步驟：

試劑準備---→離心管中依次加入各組分及樣本，混勻室溫靜置10min---→磁力架吸磁去上清---→加洗滌液，洗滌3次---→室溫乾燥，加洗脫液洗脫，上清即為遊離核酸溶液。總耗時＜1h。

（相比同類磁珠法試劑操作更簡化，實現常溫裂解、耗時更短、提取體積更大；相比離心柱法試劑，常溫裂解，無需負壓抽濾和多次高速離心，節約耗時可達20min）

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儀器提取步驟：

試劑準備---→提取板第一（排）孔中加入樣本、蛋白酶K等（此步可由儀器完成）---→提取板放入儀器中，選定程序開始運行。總耗時＜40min。

（相比同類磁珠法試劑可實現單管單人份提取，常溫裂解，洗滌次數少，時間更快，配合獨家專利旋轉式混勻提取儀，小片段DNA提取效果更佳。與離心柱法試劑相比，完成24個樣本提取耗時節約30min以上）

可配套自動化提取工作站

搭配磁力架或獨家專利旋轉式混勻自動核酸提取儀（Ballet X3 、DA3500、DA3000）進行提取。

遊離DNA臨床應用方案

【適用單位】

大型腫瘤專科醫院、三甲綜合醫院、婦產專科醫院、科研機構或第三方實驗室

（開展腫瘤液體活檢如熒光定量PCR、高通量測序、腫瘤葯敏分析、無創產篩的單位）

試劑產品列表：

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