垂花蕙蘭叢生芽途徑的組織培養技術

垂花蕙蘭叢生芽途徑的組織培養技術

垂花蕙蘭系以花葶下垂的多花蘭、硬葉吊蘭、紫紋蘭、濕地蘭、溝唇蘭、地旺蘭等為親本與大花蕙蘭雜交產生的後代，其花葶披垂生長，花多而密，且花色艷麗，開花期長1-2 個月，是享譽世界的高檔花卉之一，具有很高的觀賞價值和經濟價值。傳統的分株繁殖周期長，繁殖係數低，無法滿足生產需要。而植物組培培養技術可在較短的時間生產出大量整齊一致種苗。因此，植物組織培養技術是實現垂花蕙蘭種苗規模化生產的有效途徑。無論是地生蘭還是附生蘭其組培快繁一般採用外植體→原球莖→完整植株途徑來實現。該途徑繁殖係數高，但其再生植株容易出現變異。目前，叢生芽途徑因其再生植株變異率低的優點已在蝴蝶蘭、文心蘭和大花蕙蘭等蘭屬植物組培快繁中得到很好應用，國內有關垂花蕙蘭通過叢生芽途徑組培快繁的研究尚未見報道。本試驗從無菌材料獲得，不同濃度6-BA 對叢生芽誘導和增殖的影響，NAA、活性炭和香蕉泥對試管苗生根影響以及不同栽培基質對試管苗移栽的影響等方面進行研究，旨在建立垂花蕙蘭叢生芽增殖途徑的離體快繁技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料來自三明市農科院花卉研究所垂花蕙蘭。

1.2 方法

1.2.1 無菌材料獲得

材料的預處理：在取側芽之前，為了取得良好的消毒效果，本試驗採取以下措施：①採用溫室栽培母株；②定期給母株噴洒1000 倍50%甲基托布津藥液；③在春季晴天上午取材；④盡量取高於栽培基質的側芽。

側芽的表面消毒：用手術刀採取飽滿葉片尚未展開的側芽，切去根，在自來水下沖洗20min，轉入凈化工作台，採用以下四種方法進行表面消毒：

A：用0.1%的升汞溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，再剝去外面1-2片葉，接種到誘導培養基上培養。

B：先用72%乙醇浸泡30s，然後用0.1%的升汞溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，再剝去外面1-2 片葉，接種到誘導培養基上培養。

C：先用72%乙醇浸泡30s，然後用0.1%的升汞溶液處理8min，用無菌水沖洗3-4 次，剝去外面1-2 片葉，再用15%的次氯酸鈉溶液處理4min，無菌水沖洗3-4 次，無菌濾紙吸干，接種到誘導培養基上培養。

D：先用72%乙醇浸泡30s，然後用15%的次氯酸鈉溶液處理10min，用無菌水沖洗3-4次，無菌濾紙吸干，再剝去外面1-2 片葉，接種到誘導培養基上培養。

不同取材季節對側芽消毒效果的影響：分別在春季（3 月）、夏季（6 月）和秋季（9 月）採取側芽，用以上試驗篩選好的消毒方法C 進行表面消毒處理，接種到誘導培養基上培養。觀察不同取材季節對側芽消毒的影響。以上誘導培養基均為1/2MS+6-BA4.0 mg· L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g · L-1。

1.2.2 叢芽的誘導培養

選取垂花蕙蘭健壯、無病蟲害、葉片尚未完全展開的側芽，採用試驗篩選好的消毒方法C進行表面消毒處理，然後將消毒好的腋芽接種到6-BA 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg · L-1誘導培養基1/2MS+NAA0.1mg · L-1+AC0.5 g· L-1 上進行叢生芽的誘導。每個處理接種20個，每瓶接一個外植體，重複3 次。觀察不同濃度6-BA 對叢生芽誘導影響。

1.2.3 叢芽的增殖培養

將誘導獲得的無菌芽接種到培養基1/2MS+6-BA4.0 mg · L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g·L-1 上繼代培養3 次後獲得足夠的材料，然後接種到到6-BA 濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0 mg · L-1 增殖培養基1/2MS+NAA0.1mg · L-1+AC0.5 g · L-1 上進行增殖培養，每瓶接種3 個芽, 每處理接種10 瓶，重複3 次。觀察不同濃度6-BA 對叢生芽增殖的影響。

1.2.4 生根與壯苗培養

以大量元素減半的1/2MS 為基本培養基，設置NAA、香蕉泥和AC3 因素和3 水平，NAA水平1、2、3 分別為0.5、1.0、2.0 mg · L-1，香蕉泥水平1、2、3 分別為0、30、50 g · L-1，AC 水平1、2、3 分別為0.5、1.0、2.0 g · L-1，每處理接種2 瓶，每瓶10 株無根苗，重複3 次。

1.2.5 煉苗移栽

將生根好的試管苗放在溫室大棚煉苗4d，揭開瓶蓋繼續煉苗3d，用鑷子小心取出試管苗，洗去根部的培養基，把苗全部浸入800 倍的甲基硫菌靈藥液10 min，撈起，自然晾乾後，移栽到苔蘚、細小輕木顆粒、泥炭土、菜園土和泥炭：菜園土=1:1 基質中，放置在溫室大棚中養護，保持濕度80%左右，溫度16-28℃，定期噴曬100倍的MS培養基大量元素和800 倍70%甲基托布津藥液。60d 後統計苗的成活率。

1.2.6 培養條件

培養溫度25±1℃,每天光照12h,光照強度2000lx,培養基均添加蔗糖30 g · L-1，pH5.6。

1.2.7 統計分析方法

污染率=(污染的外植體數/接種外植體數)×100%；褐化率=(褐化的外植體數/接種外植體數)×100%；死亡率=(死亡外植體數/接種外植體數)×100%；成活率=(未褐化成活的外植體數/接種外植體數)×100%；啟動率=(啟動外植體數/存活外植體數)×100%；生根率=(生根的苗數/接種的苗數)×100%；芽增殖係數=統計時芽數/接種時芽數；平均根數=生根總數/接種苗數；移栽成活率=(成活苗數/移栽苗數)×100%。

用DPS 數據處理軟體進行試驗數據統計和分析，EXCEL 軟體進行製表和繪圖。

2 結果與分析

2.1 無菌材料獲得

2.1.1 消毒方法對側芽成活率的影響

由圖1 可以看出，四種不同消毒方法中，D方法側芽污染率最高，為69%，其次為A 方法和B方法,C方法污染率最低；而對於死亡率，D方法死亡率最低，僅為12%，其次是A 方法和C 方法,而B 方法側芽死亡率最高；從成活率來看，C方法側芽存活率最高56%，其次是A方法和B 方法,D 方法存活率最低。這表明，升汞消毒效果比次氯酸鈉好，三次消毒比一次、二次消毒效果好。

2.1.2 不同取材季節對側芽消毒的影響

由表1 可知，三個不同取材季節中，夏季取材側芽污染率最高，為32%，其次是秋季，為30%，春季側芽污染率最低，為22%；而對於褐化和死亡情況，秋季最高，其次是夏季，春季最低；從成活率來看，春季取材側芽成活率最高達54%,其次是夏季，為38%，最低的是秋季，僅為36%。試驗還發現，春季和夏季取材，側芽啟動時間短，生長速度快；而秋季取材，側芽啟動時間長，生長緩慢。因此，垂花蕙蘭側芽最佳取材季節是春季。

圖1 四種消毒方法對側芽成活率的影響

2.2 叢生芽的誘導

培養30d 後，一些腋芽基部出現萌動的小芽，極少部分腋芽基部誘導出有少量原球莖，50d 後，小芽高可達2 cm 左右。45d 後統計污染數、死亡數、存活數和啟動數，計算啟動率。由表2 可見，當6-BA 濃度為0.5 mg · L-1 時，叢生芽誘導啟動率最低，僅為47.1%。當6-BA濃度為4.0mg·L-1 時，叢生芽誘導啟動率最高達100%。6-BA 濃度在0. 5-4.0 mg · L-1 範圍之間，垂花蕙蘭叢生芽啟動率隨6-BA 濃度增加而提高。6-BA 濃度在0. 5-2.0 mg · L-1 之間，芽分化較少。6-BA 濃度為4.0mg · L-1 時，芽分化較多。因此，4.0 mg · L-16-BA 適合叢生芽誘導。

2.3 叢芽的增殖培養

將誘導培養獲得的無菌芽接種到1/2MS+6-BA4.0mg · L-1+NAA0.1mg · L-1 上繼代培養3 次後，選取生理狀態和大小基本一致的芽，接種到叢生芽增殖培養基上。60d 後統計芽的個數，計算增殖係數。由表3 可看出，當6-BA 為6.0mg · L-1 時，叢生芽增殖倍數最大，為4.1。當6-BA 濃度為在2.0-6.0mg · L-1之間，叢生芽數隨其濃度增大而提高。但當6-BA 為8.0 mg · L-1 時，叢生芽增殖係數降至3.2。叢生芽質量隨著6-BA 濃度增大逐漸由健壯變為纖弱。適當提高6-BA 濃度有利於叢生芽的增殖，濃度過高，則抑制叢生芽的增殖。綜合考慮，本試驗6-BA濃度4.0mg·L-1 適合叢生芽增殖。

將誘導培養獲得的無菌芽接種到1/2MS+6-BA4.0mg · L-1+NAA0.1mg · L-1 上繼代培養3 次後，選取生理狀態和大小基本一致的芽，接種到叢生芽增殖培養基上。60d 後統計芽的個數，計算增殖係數。由表3 可看出，當6-BA 為6.0mg · L-1 時，叢生芽增殖倍數最大，為4.1。當6-BA 濃度為在2.0-6.0mg · L-1之間，叢生芽數隨其濃度增大而提高。但當6-BA 為8.0 mg · L-1 時，叢生芽增殖係數降至3.2。叢生芽質量隨著6-BA 濃度增大逐漸由健壯變為纖弱。適當提高6-BA 濃度有利於叢生芽的增殖，濃度過高，則抑制叢生芽的增殖。綜合考慮，本試驗6-BA濃度4.0mg·L-1 適合叢生芽增殖。

2.4 生根與壯苗培養

將叢芽增殖獲得的無根試管苗切成單株，選取大小基本上一致的苗轉接到生根壯苗培養基上，40d後一些試管苗基部分化出根原基，45d天后可形成約2cm 長的根。生根培養50d 後統計各處理平均生根率和平均根條數，結果見表4。

由生根率方差分析(表5)可知，NAA 對叢芽增殖苗生根率影響極顯著，香蕉泥對生根率影響顯著，而活性碳對生根率影響不顯著。說明NAA 是影響生根率最主要因素。香蕉泥對試管的生根率也有促進作用。由生根數方差分析(表5)可知，NAA 和香蕉泥對叢生芽增殖苗生根條數有極顯著影響，活性炭顯著影響生根數。比較NAA 和香蕉泥的F 值可知，NAA 是影響叢生芽增殖苗生根的最主要因素，其次香蕉泥，再次是活性炭。對NAA、香蕉泥和活性碳各水平進行多重比較見表6。

由表6 可知，NAA三水平間，NAA水平3（2mg·L-1）的生根率和平均根數與水平1（0.5mg · L-1）、水平2（1 mg · L-1）差異極顯著，水平2（1 mg · L-1）與水平1（0.5 mg · L-1）差異也極顯著。可以說明，在0.5-2.0mg · L-1 濃度範圍，生根率和平均根數隨NAA 濃度升高而升高。NAA 濃度為2.0mg · L-1 時，生根率最高，平均根數也最多。

由表6 可以看出，香蕉泥三水平間，水平3（50 g · L-1）生根率與水平1（0 g · L-1）差異顯著，水平3（50 g · L-1）與水平2（30 g · L-1）、水平1（0 g · L-1）與水平2（30 g · L-1）差異不顯著。三水平之間的平均根數差異極顯著。說明，添加一定量的香蕉泥能促進根的生長，本試驗香蕉泥濃度為50 g · L-1 時，生根效果最好。

由表6 可知，AC 三水平的生根率差異不顯著。水平2（1 g · L-1）平均根數與水平1（0.5g · L-1）、水平3（2 g · L-1）差異顯著。平均生根數隨著AC 濃度升高先升高後降低，本試驗AC 濃度為1 g · L-1 時，生根培養效果最好。

綜上所述，適宜垂花蕙蘭叢生芽苗生根培養基配方為1/2MS+NAA2.0 mg · L-1+香蕉泥50 g · L-1+AC1 g · L-1。

2.5 煉苗和移栽

由表7 可看出，五種基質中，以苔蘚為最好，成活率可達100%，苗生長健壯，葉片濃綠富有光澤；其次是細小輕木顆粒，成活率為86%，苗生長較好，葉片黃綠根系發達；泥炭土移栽效果一般，成活率也只有68%；移栽效果最差的基質是菜園土，成活率為54%，苗呈萎蔫狀，不生長。可見，本試驗垂花蕙蘭瓶苗移栽最佳基質是苔蘚。

3 討論和結論

無菌材料的獲得是組培快繁的首要任務。母株材料的前處理、消毒藥劑、消毒時間和取材季節等因素均會影響無菌材料獲得。本試驗發現，升汞消毒效果比次氯酸鈉好，採用不同消毒劑多次消毒比單一消毒劑消毒效果好。該試驗結果與金雪瓊等在文心蘭外植體消毒的試驗結果基本相同。這表明，表面消毒效果較差的消毒劑殺滅微生物能力較弱，同時對外植體材料毒副作用較小，而表面消毒效果較好的消毒劑殺滅微生物能力較強，同時對外植體材料毒副作用較大。因此，在外植體表面消毒時為獲得較多的無菌材料宜採用消毒能力強與消毒能力弱的消毒劑對外植體進行多次消毒。本試驗還發現，取材的季節對無菌材料獲得也有較大的影響，春季取材容易獲得高質量的無菌材料。這與余道平在春蘭上的研究結果基本一致。這可能與春季氣溫相對較低，外植體上的雜菌不容易滋生且春季有利於側芽啟動有關。

6-BA是人工合成的細胞分裂素，可促進細胞分裂，誘導愈傷組織發生，打破頂端優勢，促進側芽發生和誘導休眠芽生長等生理作用，具有高效、穩定、廉價和易於使用等特點，在植物組培培養中得到廣泛應用。在蝴蝶蘭、文心蘭和大花蕙蘭等觀賞植物叢芽的誘導和增殖中6-BA 是一個關鍵的因素。李金雨等研究發現，6-BA 能促進蝴蝶蘭叢芽誘導和增殖。劉麗鋒等報道在大花蕙蘭叢芽誘導和增殖中6-BA起關鍵作用。崔光榮等研究結果表明，一定濃度的6-BA 能促進文心蘭叢生芽增殖。本試驗也發現，6-BA 可促使垂花蕙蘭側芽誘導形成叢生芽。濃度為4.0 mg · L-1 時，叢生芽誘導效果佳。這可能是因為供試外植體內源細胞分裂素含量較低，需要外加較高濃度的細胞分裂素誘導其叢生芽發生。在增殖培養階段，維持較高濃度的6-BA對垂花蕙蘭叢芽增殖有促進作用。但6-BA 濃度過高時，叢生芽變弱易脆甚至降低叢芽的增殖係數。這可能是由於叢生芽在增殖培養過程中吸收並累積過多外源細胞分裂素6-BA 所致。至於其它植物生長調節劑如KT、ad 和TDZ 對垂花蕙蘭叢芽誘導或增殖是否有益有待於進一步研究。

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