土壤Cd污染對跳蟲Folsomia candida的生態毒性

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來源：《生態毒理學報》2017年2期

作者：保瓊莉1，李文華1，黃益宗1,*，劉仲齊1

單位：農業部環境保護科研監測所重金屬生態毒理研究室

摘要：採礦及冶煉等行為造成了嚴重的土壤重金屬污染，其中Cd污染及其帶來的健康風險近年來引起人們的高度重視。利用彈尾目跳蟲開展土壤Cd污染的生態毒理研究，對Cd污染土壤的生態風險評價具有重要意義。本研究將跳蟲Folsomia candida(F.candida)暴露在不同Cd濃度污染的人工土壤中，利用跳蟲存活數量、繁殖數量及迴避行為實驗來評價重金屬Cd污染對跳蟲的生態毒性。結果表明，Cd對F.candida的急性毒性LC50值為2086.93mg·kg-1，慢性毒性的繁殖抑制(28d)EC50值為224.95mg·kg-1。此外，Cd對跳蟲迴避行為影響的EC50(48h)為721.26mg·kg-1。可以看出，慢性毒性的EC50值與Cd對迴避行為影響的EC50值近似，但遠低於急性毒性LC50值。因此，跳蟲F.candida的迴避行為和繁殖率對Cd污染土壤有較高的靈敏度，可用來表徵土壤中Cd的生態毒性。

隨著社會經濟的發展，人類工農業生產過程中產生的各種污染物通過不同途徑進入土壤環境，最終超過土壤自凈能力，使土壤質量與功能發生變化，危及人類及其他生物的生存和發展，即土壤污染。土壤作為一個開放體系，與其他生態系統有著重要的交互作用，研究重金屬污染土壤意義重大。目前，土壤重金屬污染受到全球性的關注。土壤重金屬污染成為食品安全及人類健康的最大風險。土壤重金屬除了來自土壤母質外，其他來源都與人為活動密切相關，包括採礦、冶煉、污水灌溉、污泥再利用及農業化肥等，其中採礦是最嚴重的重金屬污染源。在諸多重金屬中，Cd污染及其帶來的健康風險越來越引起人們的高度關注。如Liu等發現在尾礦覆蓋的土壤中Cd濃度達到了安全值的13倍。Li等統計了2005—2012年間發表的有關我國重金屬污染的數據，發現我國有65%的礦區中Cd的重金屬地質累積指數Igeo超過4級(重金屬含量為背景值的100倍時，劃為第六等級)，據Igeo推斷Cd污染程度最高。Zhuang等的研究表明水稻土中的Cd濃度達到了我國土壤環境質量二級標準的13倍。Cd沒有任何必需的生物學功能，在生物體內達到一定濃度時都會損壞生物細胞膜，能與硫基基團(-SH)結合，進而會影響人體多種酶的活性，影響細胞內正常的生理功能、並破壞生物體的DNA結構。

跳蟲又名彈尾蟲(springtails)，是彈尾綱(collembolan)生物的俗稱，是一種分布極為廣泛的土壤節肢動物，與線蟲、蟎蟲共同構成三大土壤動物，在土壤生態系統中扮演著重要角色。跳蟲是土壤生態系統的重要組成部分，它們通常個體小，與土壤顆粒和孔隙水直接接觸，將它們暴露在污染土壤中，其毒害效應要比其他動物更容易被觀測到。跳蟲因生長周期短，繁殖快，易於實驗室人工培養，操作簡便等優勢，被長期用於土壤生態毒理學實驗，成為土壤生態風險評價中重要的模式生物。而白符跳蟲(Folsomia candida)則是在生態毒理實驗中應用最為廣泛，技術最為成熟的一種跳蟲。F.candida是目前在土壤生態風險評價中應用最為廣泛的一類跳蟲，F.candida的棲息地主要是有機質含量比較高的地區。F.candida有非常發達的彈器，受到外界刺激會很快做出反應並且出現彈跳行為。F.candida為卵生，生殖方式為孤雌生殖。

國外利用跳蟲開展生態毒理研究較早，國內的研究相關報道較少。有關重金屬對跳蟲的毒理效應研究主要集中在Hg和Cu等污染，而Cd污染的研究較少有報道。隨著ISO 11267和ISO 11573跳蟲毒理實驗國際標準的發布，利用跳蟲來評價土壤環境中重金屬污染有了指導規範。本研究以跳蟲F.candida為實驗材料，探討了不同濃度的土壤Cd污染對跳蟲生存、繁殖和迴避行為的影響，獲得相關的毒理數據，為開展Cd污染的土壤生態風險評價提供基礎數據。

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材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：人工氣候箱(三洋MLR-351H)，體視顯微鏡(奧林巴斯SZ610)，AR224CN型電子天平，YD126-KD-8089型計數器，其他儀器為實驗室常規儀器。

主要試劑：CdCl2，分析純，購自國葯試劑公司。

1.2 實驗動物與培養條件

供試跳蟲F.candida，孤雌生殖，來自中國科學院生態環境研究中心。跳蟲培養方法：跳蟲放入90mm×13mm的培養皿中飼養，培養皿底部有一層約0.5cm厚的石膏/活性炭基質(熟石膏、活性炭和蒸餾水按9∶1∶7的質量比混合而成)，加入少量乾酵母作為跳蟲的食物，每周換食並補充水分，清除培養基上的食物殘渣和跳蟲屍體，保持培養基清潔濕潤，每2個月更換一次培養基。培養皿放入人工氣候箱中，溫度為(20±1)℃，濕度為(70%±5%)，12h∶12h的光照與黑暗循環，光照強度為400~800lux。

1.3 實驗方法

1.3.1 跳蟲同齡化

為了降低跳蟲蟲齡和個體大小差異對實驗的影響，實驗前跳蟲需進行同齡化。參考ISO 11267-1999中跳蟲同齡化方法進行實驗操作。從跳蟲數量多並且活躍的培養皿中轉移約60隻成蟲至新的有基質的培養皿中，加入乾酵母，然後放入培養箱中培養，每天進行觀察。當發現有幼蟲孵出時移走成蟲，此後第3天將幼蟲轉移到新的培養皿中培養，這些幼蟲即可認為是同齡化的跳蟲，F.candida幼蟲培養至9~12d 即可用於實驗。

1.3.2 人工土壤配製

將10%的泥炭(無明顯植物殘體，自然風乾2d，烘乾1d，並過2mm篩)、20% 的高嶺土(粉末狀，高嶺石含量>30%)和70%的石英砂(至少50% 的顆粒粒徑範圍為0.05~0.2mm)混合均勻，調節土壤含水量為最大持水量的45%，有機質含量為7%，用CaCO3調節pH至6.0±0.5，密封室溫保存。由於土壤pH、有機質含量及含水量對跳蟲的生長繁殖有一定的影響，為了消除其他因素對實驗的干擾，我們採用了ISO 11267-1999 推薦的人工土壤進行實驗。石墨爐原子吸收光譜法測定人工土壤的Cd含量為0.001mg·kg-1。

1.3.3 Cd污染人工土壤的製備

參照ISO 11267-1999，溶於水的化學品，以溶液的形式噴洒入人工土壤。Cd以CdCl2形式加入，先按設定濃度稱取CdCl2試劑，然後將稱好的CdCl2溶於去離子水中，用小噴壺均勻噴洒於人工土壤中並充分混勻。土壤染毒後，再補充去離子水至最大持水量的50%。對照中不加Cd，調節土壤含水量至最大持水量的50%。染毒土壤及對照均在20℃的黑暗條件下平衡48h。

1.3.4 急性存活實驗

1)濾紙法急性存活實驗(實驗方法參照ISO 11267-1999)：設置8 個Cd濃度處理，分別為0、200、400、800、1600、2400、3200、4000 mg·kg-1，每處理設置5個重複，對照組設6個重複；在培養皿中鋪墊上濾紙，加入不同濃度的Cd溶液，剛好浸透濾紙，每隔24h加入微量蒸餾水補充蒸發水分，以保持濾紙濕度，各培養皿中加入同步化的成蟲，在人工氣候箱中培養，培養條件同跳蟲飼養條件；在培養24h、48h及72h觀察跳蟲死亡情況，記錄死亡個數。

2)人工土壤急性存活實驗(實驗方法參照ISO 11267-1999)：設置8個Cd濃度處理，分別為0、200、400、800、1600、2400、3200、4000mg·kg-1，每處理設置5個重複，對照組設6個重複。將30g染毒土壤裝入100mL燒杯中，然後每個燒杯中加入已同齡化的10隻跳蟲，用封口膜封口，在人工氣候箱中培養，培養條件與跳蟲飼養條件相同。實驗進行7d後取出燒杯，加入一定量的蒸餾水，存活的跳蟲因體表分泌油脂會漂浮到水面上，用水懸浮法記錄存活跳蟲的數量。

1.3.5 迴避實驗

實驗方法參照ISO 17512-2，略有改動。設置8個Cd濃度處理0、50、100、200、400、600、800、1000mg·kg-1，每處理設置4個重複，用隔板將迴避實驗用的特製圓柱形玻璃杯分隔為兩部分，兩部分分別加入30gCd污染土壤和對照土壤，然後將隔板取出，在玻璃杯的中心位置加入已經同齡化的20隻跳蟲，再用封口膜進行封口，放入人工氣候箱中進行培養，培養條件同跳蟲飼養條件。跳蟲培養48h後取出玻璃杯，小心插入隔板，將兩部分土壤分別取出，再用水懸浮法計數跳蟲數量。迴避率計算方法：X=nc/N×100%(X為迴避率；nc為對照土壤中跳蟲數量；N為加入土壤中的總跳蟲數)，即空白對照土壤中的跳蟲佔總跳蟲數的百分比。當空白對照土壤中的跳蟲數量佔總數的70% 以上時，可認為污染物對跳蟲的環境行為產生了明顯影響。實驗過程如圖1。

1.3.6慢性繁殖抑制實驗

實驗方法參照ISO 11267-1999，略有改動。設置Cd污染7個濃度處理0、20、80、150、300、600、1200mg·kg-1，每組處理設置5個重複，對照組為6個重複。將30g Cd土壤加入100mL的燒杯中，然後將10隻同齡化跳蟲放入裝有Cd污染土壤的燒杯中，同時加入5mg乾酵母作為跳蟲食物，封口膜封口燒杯，然後放入人工氣候箱中培養，培養條件與跳蟲飼養條件相同，每周開口通氣，清除土壤表面雜質及腐爛食物，補充1mL 去離子水，補充少量乾酵母(約2mg)。實驗進行28d後取出燒杯用水懸浮法分別記錄成蟲和幼蟲的數量。實驗過程如圖2。

1.4 數據處理

數據用平均值±標準差(mean ± SD)表示，採用SPSS 16.0、SAS 軟體對實驗數據進行分析，顯著性差異採用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，SSR法進行平均數間的多重比較，P50)和半數效應濃度(EC50)。

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結果與分析(Results and analysis)

2.1 濾紙法急性存活實驗

濾紙法跳蟲存活實驗結果如圖3，在Cd污染濃度低於3200mg·kg-1的濾紙上暴露24h後，跳蟲未受影響，而當Cd污染濃度達到4000mg·kg-1時，存活跳蟲數量顯著降低(存活8隻)(F=5.65，P-1的濾紙上暴露48h後，存活跳蟲數量有下降趨勢，當Cd污染濃度達到4000mg·kg-1時存活跳蟲顯著降低(存活7隻)(F=7.43，P-1的濾紙上暴露72h後，存活跳蟲數量開始下降，當Cd污染濃度大於800mg·kg-1時，存活跳蟲數量顯著下降(F=23.24，P跳蟲在不同Cd污染濃度下暴露不同時間後，存活的跳蟲數量不同。暴露時間越長，相同Cd污染濃度對跳蟲毒害程度越大。

2.2 人工土壤急性存活實驗

人工土壤跳蟲急性存活實驗結果如圖4，隨著Cd濃度的增加死亡的跳蟲數逐漸增加，存活數減少，在Cd濃度大於400mg·kg-1時，各個濃度處理條件下，跳蟲存活數與對照中跳蟲存活數均有顯著性差異(F=48.94，P-1時，跳蟲幾乎全部死亡。跳蟲的急性存活實驗靈敏度較低，一般作為迴避實驗和繁殖實驗的預實驗，以便確定後續實驗的Cd濃度。

2.3 迴避實驗

如圖5所示，隨著Cd濃度的增加，跳蟲的迴避率逐漸提高，在Cd濃度為1000mg·kg-1時，跳蟲迴避率達82.5%。在設定的Cd濃度大於200mg·kg-1時，跳蟲開始表現出迴避行為。在Cd濃度為800mg·kg-1時，跳蟲迴避率超過70%，跳蟲表現出明顯的迴避行為。可以看出，跳蟲的急性迴避實驗周期短，比急性存活實驗更加靈敏，能夠更靈敏地表徵Cd對跳蟲的生態毒性。

2.4 慢性繁殖抑制實驗

如圖6所示，跳蟲成蟲數量沒有隨Cd濃度的增加而明顯減少，僅在最高濃度1200mg·kg-1時有部分成蟲死亡。跳蟲繁殖的幼蟲數量隨著Cd濃度的增加而減少，在Cd濃度大於80mg·kg-1的各處理，幼蟲數量與對照組之間均有顯著性差異(F=119.14，P-1)，跳蟲繁殖的幼蟲數量僅為對照組的6%，表明Cd對跳蟲的繁殖有抑制作用，產生了慢性毒性效應。跳蟲繁殖幼蟲的數量一般同成蟲數量保持正相關，成蟲死亡數增加，繁殖幼蟲數量減少，與本實驗相符。一般隨著污染物濃度的增加，跳蟲繁殖幼蟲數量會不斷減少。

2.5 跳蟲實驗參數比較

用半數致死濃度LC50和半數效應濃度EC50來評價Cd對跳蟲毒性大小(表1)。Cd對跳蟲的半數致死濃度LC50為2086.93mg·kg-1；跳蟲的迴避行為半數效應濃度EC50為721.26mg·kg-1；Cd對跳蟲繁殖毒性的半數效應濃度EC50為224.95mg·kg-1。可以看出，EC50要遠小於LC50，EC50更靈敏。表明迴避實驗和慢性毒性實驗更適合進行Cd的生態毒性評價，且繁殖抑制對土壤Cd污染更敏感。

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討論(Discussion)

在我國，有關Cd對F.candida的毒理效應的基礎研究仍比較缺乏，利用人工土壤研究Cd對F.candida的毒性，能夠為我國以Cd污染自然土壤為基質研究Cd對F.candida毒理效應提供參考，同時為研究Cd污染土壤的生態風險評價提供基礎毒理數據。跳蟲的4種毒性實驗均能從不同方面表徵土壤中Cd的生態毒性，其中急性毒性實驗和迴避實驗暴露時間較短，用於評價重金屬Cd對跳蟲的急性毒性。而繁殖實驗暴露時間較長，用於評價重金屬Cd對跳蟲的慢性毒性。

濾紙法是一種皮膚染毒的方式，該方法便捷方便。濾紙法實驗結果所顯示的只是通過皮膚接觸溶液所產生的毒性信息，較難反映重金屬對環境的真實影響，但可以用於重金屬對跳蟲的潛在毒性的早期評估實驗。土壤暴露實驗可能較溶液暴露實驗更能反映實際的環境影響。實際環境中重金屬對跳蟲的毒性可能不僅取決於重金屬本身的毒性，而且可能與重金屬在土壤中的行為及在跳蟲體內的代謝過程相關。人工土壤法能夠儘可能模擬自然土壤環境，使實驗結果儘可能真實地反映自然界中重金屬對跳蟲的實際影響。Krogh研究表明標準土壤實驗中Cu對彈尾目F.candida的LC50平均值為1541mg·kg-1，本研究中Cd對F.candida的LC50值為2086.93mg·kg-1，表明不同重金屬對跳蟲的LC50值在不同的研究系統中有較大差異。重金屬Hg對土壤跳蟲的毒性研究有一些報道，如近期劉傳棟等研究了我國4種土壤跳蟲對重金屬Hg的響應，利用Bliss 法測得4種跳蟲的LC50值在35~92mg·kg-1之間；董繼鑫等研究發現Hg在不同類型土壤中對F.candida的LC50為0.92~1.9。這些研究結果與本實驗中Cd對F.candida的LC50有很大差異，這可能與跳蟲自身性質差異、重金屬類型、重金屬脅迫時間以及LC50的計算方法等有關係。

繁殖率的降低是生物體應對外界污染的措施，會直接影響種群的數量。因此繁殖率作為亞致死劑量水平研究的指標，一直是土壤污染物毒性研究的一個重要指示因子。跳蟲繁殖率的EC50具有很高的有效性。本研究的繁殖抑制實驗中EC50值為224.95mg·kg-1，明顯低於LC50值(2086.93mg·kg-1)，說明在土壤污染生態風險評估方面，跳蟲的繁殖率實驗優於跳蟲死亡率實驗。早期Sandifer和Hopkin研究發現Cd對F.candida繁殖抑制的EC50值為590mg·kg-1，高於本研究的EC50。Crommentuijn等的研究表明當Cd濃度達到326mg·kg-1時，F.candida的繁殖仍未受影響，而Menta等的研究得出Cd對F.candida繁殖抑制的EC50值僅為47.2mg·kg-1。Bur等利用法國西南部的耕作土壤研究Cd對F.candida繁殖抑制的EC50值為182mg·kg-1。vanGestel和Mol利用人工土壤研究Cd對F.candida的毒性效應，其繁殖抑制半數效應濃度為193mg·kg-1，該值與本研究的結果較一致。表明土壤性質對Cd的跳蟲毒性效應有重要影響。其他重金屬的相關研究國內也已有報道，如近期董繼鑫等研究發現Hg在不同土壤類型中對F.candida繁殖抑制的半數效應濃度值在0.98~2.43的範圍，且土壤陽離子交換量(CEC)與EC50濃度呈顯著正相關關係，指出CEC可能是導致不同類型土壤中Hg對F.candida的毒性差異的主要原因。Liu等利用北京市郊區農田土壤研究Hg對跳蟲的毒性效應，其繁殖抑制半數效應濃度EC50為9.28mg·kg-1，該值顯著低於本研究中Cd對F.candida繁殖抑制的EC50值，這可能與重金屬本身及研究系統不同有關。另外，岳蕊麗等研究發現低濃度的Cu能促進跳蟲的繁殖，而本研究中低濃度的Cd處理並未促進跳蟲的繁殖。

研究表明，跳蟲能夠感知土壤污染物的存在，從而發生遷移行為，迴避實驗可以作為土壤污染的早期預警工具。本研究中不同Cd暴露濃度下迴避實驗顯示F.candida表現出對Cd污染的迴避行為，對於高濃度Cd污染的土壤有明顯的迴避行為。迴避反應的差異性可能與人工土壤中Cd的不均勻分布有關。本研究迴避實驗中EC50值為721.26mg·kg-1，高於慢性繁殖率實驗的EC50值(224.95mg·kg-1)，表明對Cd污染的敏感度較死亡率的更高，而低於繁殖率實驗的敏感度。本研究中F.candida能夠對約1/3LC50的Cd濃度產生明顯迴避行為。李曉勇等對Cu的跳蟲毒性研究發現，迴避實驗中跳蟲對Cu污染的敏感性要高於死亡率實驗和慢性繁殖抑制實驗。Liu等研究發現Hg對跳蟲迴避行為的EC50值甚至低於LC50的一半，表明F.candida對重金屬污染的敏感性與重金屬類型有關。跳蟲在有機物污染的土壤中，其迴避實驗也表現出很高的敏感性。如張軒等發現全氟辛烷磺酸鹽(POFS)以及添加型溴代阻燃劑DBE-209對F.candida迴避行為的EC50值顯著低於LC50值，而高於慢性繁殖的EC50值。張偲等考察2種有機磷阻燃劑鄰磷雜菲基對苯二酚(ODOPB)和高分子雙酚A四苯基雙磷酸酯(SBDP)對F.candida毒理效應，發現繁殖抑制的EC50遠大於迴避行為的EC50，表明F.candida的迴避行為對不同污染物的敏感性有很大差異。本研究表明慢性繁殖抑制實驗對Cd土壤污染最敏感，用作土壤Cd污染生態風險評估的早期預警工具更具有優越性。

通訊作者簡介：黃益宗(1970—)，博士，研究員，主要從事重金屬在土壤和植物系統中的遷移和轉化、污染土壤修復、酸沉降和臭氧污染脅迫對典型農田、森林生態系統影響機理等方面的研究工作。

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