惡性腫瘤的致病性胚系突變圖譜

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常見突變僅能解釋比例有限的腫瘤遺傳負荷，報道過的大部分胚系突變只關注單一癌症類型，然而越來越多證據顯示共同易感因子貫穿於不同癌症類型。本文編譯至4月在Cell上發表的癌症基因組圖譜的系列研究文章之Pathogenic Germline Variants in 10,389 Adult Cancers。該研究代表目前最全面的罕見胚系易感突變的研究，為了解它們在癌症中的功能奠定了基礎。

本研究編碼了GenomeVIP突變識別系統 (https://github.com/ding-lab/GenomeVIP)，得到286,657.499個外顯子突變。並分析了10,389例的致病突變，樣本覆蓋度良好、無無關的突變識別、與單核苷酸多態性( SNP )陣列數據高度一致。這些資源在癌症研究者社區雲端分享。

發現33種癌症類型的致病突變

此外，研究團隊開發了CharGer突變自動分類管道平台(https:// github.com/ding-lab/CharGer)，可查詢ClinVar信息，提交突變體及報告疾病-基因關聯。並針對易感基因開發了TP53、BRCA1、BRCA2、RET及TERT等基因特異性資料庫，梳理出152個促癌易感基因。CharGer評估後，ClinVar及梳理資料庫中的已知致病性突變被標記為致病，CharGer評分＞8標記為疑似致病，CharGer評分＞4標記為優先不明意義突變。在PCGP專家組分類的兒科癌症中發現883個胚系突變，致病突變檢測靈敏度為88 %，假陽性率為4.9 %。

在所有癌症類型中，4.1 %的樣本( n = 428 )攜帶致病突變，另有3.8 % ( n = 390 )攜帶可能致病突變。致病或可能致病突變的出現頻率在不同癌症類型中差異很大，從嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤驚人的22.9%到膽管細胞癌罕見的2.2%不等。卵巢漿液性囊腺癌19.9 % 和浸潤性乳腺癌9.9 %頻率較高。暴露於環境因素的其它癌症組織類型，如皮膚黑色素瘤6.2%及葡萄膜黑色素瘤5%。22.9%的嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤、14.1%的胰腺癌及12.5%的肉瘤樣本攜帶這類突變，表明罕見致病性胚系易感突變在這些腫瘤類型中起重要作用。

對每種癌症類型富集的致病或可能致病突變基因也進行了研究。與非TCGA隊列的外顯子組集合體中的致病和可能致病突變比較，識別出具有高富集性的癌症類型；然後針對餘下所有的癌症類型進行單癌類型全頻率檢測，減去潛在富集每種基因的類型。共確定了28種特異性癌症基因關聯和16種提示性關聯，大多數負荷試驗為已知關聯。如BRCA1和BRCA2致病或可能致病突變在卵巢漿液性囊腺癌和浸潤性乳腺癌中高度富集，同時BRCA2也在胰腺癌中明顯富集。嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤與RET、SDHB、VHL、NF1、SDHD和MAX等多種易感基因相關。

幾個新的發現提示意料之外的胚系易感基因和腫瘤相關。五例胃腺癌患者攜帶五種PALB2基因功能丟失突變（無義和移碼突變），其中2例還攜帶可變雜合性丟失，與其它PALB2相關腫瘤類似。同樣，3例黑色素瘤患者的SDHA基因攜帶三種功能喪失突變且表達水平極低，而以前該基因與黑色素瘤易感無關。兩例肺鱗癌和三例多形性膠質母細胞瘤患者攜帶相同的罕見BUB1B錯義突變p.Q912H。在小鼠模型中已證實，BUB1B的單倍劑量不足增加致癌物誘導的肺癌發生。結果揭示了新的癌症易感關聯，值得深入研究。

突變水平上，在66個腫瘤抑制基因中確定了659個致病或可能致病突變；在RET、AR、PTPN11、MET和CBL五種致癌基因中發現了33種致病或可能致病突變；11種癌症類型中有21個RET突變，一些是癌症特異性的，如所有三種致病METp.H1112R突變在乳頭狀腎癌中都有，證實遺傳腎乳頭狀細胞癌中的突變共分離。對於抑癌基因，在至少18種癌症類型中鑒定出57個ATM、36個BRIP1和29個PALB2突變。相比下，多個其它抑癌基因在特定癌症類型中富集，如BRCA1、BRCA2在浸潤性乳腺癌和卵巢漿液性囊腺癌中富集。環狀結構域中有BRCA1p.C61G致病突變的所有4個腫瘤都是浸潤性乳腺癌。

二次突變

研究團隊使用先前開發的統計學檢驗研究雜合性丟失的程度。證實，抑癌基因中的154個雜合性丟失是因野生型等位基因缺失造成的。

具有高遺傳易感的癌症類型中有高雜合性丟失。包含BRCA1p.Q1777fs、p.D825fs、p.W372*和p.E797*突變的四個卵巢漿液性囊腺癌樣本均表現出高度顯著的雜合性丟失，而含BRCA2p.E1857fs、p.E294*和p.Y1762*在其它3個卵巢漿液性囊腺癌樣本中也顯示出高度雜合性丟失。比較BRCA1/2在不同癌症中的雜合性丟失率，發現大多數BRCA1/2突變在卵巢漿液性囊腺癌中表現出雜合性丟失，而在浸潤性乳腺癌中比例略低，在其它癌症中更低，但仍有11個明顯例外腫瘤。在卵巢漿液性囊腺癌樣本中BRIP1p.S624*突變顯示了三個獨立ClinVar的致病證據，並有強雜合性丟失。在浸潤性乳腺癌和卵巢漿液性囊腺癌中RAD51Cp.R193*顯示雜合性丟失，但在皮膚黑色素瘤中無。METp.H1112R突變導致NIH 3T3細胞惡性轉化，在三個腎乳頭狀細胞癌樣本中的兩個發現有突變等位基因擴增，表現為雜合性丟失。這些胚系突變在腫瘤中的陽性選擇進一步證實了它們的臨床相關性。

二次突變假設的另一種表現形式是致病或可能致病胚系突變與易感基因的其它拷貝發生體細胞突變偶聯。分析腫瘤隊列共篩選出37個候選雙等位基因突變。ATM基因的6個胚系突變中，有2個p.T2333fs、1個p.S2289fs、1個p.R23*、1個p.E1267fs及1個起始丟失突變，均與體細胞ATM突變偶聯。三例攜帶不同BRCA2胚系截短突變，包括p.T1598fs、p.A23 14fs和p.Q1037*，也偶聯BRCA2體細胞突變。一例結腸癌樣本攜帶了一個MSH6p.R248fs胚系突變和一個在所有測序讀長中都互斥的p.R248*體細胞突變，明顯支持了兩個等位基因的二次突變。

多抑癌基因也顯示出與二次突變假說一致的表達模式。35歲的非裔美籍腎乳頭狀細胞癌患者攜帶致病FHp.S187*胚系突變和體細胞剪接位點FH突變，且FH表達低（腎乳頭狀細胞癌僅2.07%）。膀胱尿路上皮癌樣本攜帶CHEK2胚系p.W93*突變，與四個不同的CHEK2體細胞突變複合，CHEK2低表達（在膀胱尿路上皮癌中佔1.7%）。顯然，多種腫瘤類型的雜合性丟失及易感等位基因的雙等位事件，為二次突變假設提供了支持。

突變攜帶者基因產物的表達變化

此外分別研究了致病或可能致病胚系突變攜帶者的基因和蛋白表達情況，共確定了15個顯著和6個提示性基因-癌關聯。

在乳腺癌中，FANCM、ATM、BRCA2、CHEK2和BRCA1攜帶者中這些基因的表達顯著降低。在嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤中，RET攜帶者的RET基因表達較高，而SDHB、NF1和SDHD攜帶者表達較低。除乳腺癌外，肺腺癌和低級別膠質瘤ATM攜帶者表達顯著降低。再用RPPA數據進行相同分析，研究影響是否延伸到蛋白和蛋白磷酸化水平。值得注意的是，胃腺癌、胰腺癌、前列腺癌、浸潤性乳腺癌和低級別膠質瘤五種癌症類型的ATM攜帶者與低蛋白表達顯著相關。CHEK2攜帶者在浸潤性乳腺癌中Chk2生物標記物蛋白表達明顯較低，而在膀胱尿路上皮癌中提示低表達。

總體而言，對比致癌基因，抑癌基因的致病或可能致病胚系突變與低基因表達分布相關：47.6%的抑癌基因突變在下部1/4分位數。相反，62.1%癌基因中的突變在上端1/4分位數，表明攜帶致病或可能致病突變的抑癌基因和癌基因有不同的轉錄調控。

在突變體水平上，有METp.H1112R突變的全部三個腎乳頭狀細胞癌腫瘤MET基因表達均為上部1/4分位數。12例攜帶易感RET等位基因的患者在各自癌症隊列中高表達RET基因，其中包括9例嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤病例，特別是3例RET攜帶者，非典型性地與多髮型內分泌腫瘤2型相關，包括低級別膠質瘤中的p.I852M（96%）、腎乳頭狀細胞癌中的p.D631Y（84%）和直腸腺癌中的p.R912P（80%）。乳腺癌PTPN11攜帶者的p.N58S和p.T411M兩個突變也有較高的表達（＞88%）。在腫瘤中高表達的突變相關癌基因，許多檢測不到拷貝數擴增，表明癌細胞可能優先上調致癌基因的致病等位基因。

罕見的胚系拷貝數突變

研究團隊系統地掃描了10,389個樣本罕見的胚系拷貝數突變，在癌症隊列的28個相關癌-基因對中，發現18個標記了11種抑癌基因拷貝數缺失。3例浸潤性乳腺癌和2例卵巢漿液性囊腺癌顯示BRCA1缺失；2例腎透明細胞癌伴隨VHL缺失，2例浸潤性乳腺癌和2例前列腺癌伴ATM缺失。其它受缺失影響的基因包括FH、MSH6、NF1、PALB2和PTEN。

進一步在特定癌症類型的易感基因中又檢測到這些缺失的轉錄效應： 9（/14）例典型樣本在各自的癌症隊列中在下部1/4分位數位置表達，而其它受影響的樣本缺失並不與基因低表達一致。

支持致病的獨立基因組證據

研究團隊尋求獨立的證據來證實已鑒定的853種致病或可能致病突變的致病性，包括：（1）在單突變水平上對比非癌症樣本，癌症樣本顯著富集;（2）將兒科腫瘤中發現的致病胚系等位基因突變與複發的體細胞突變共定位；（3）與翻譯後修飾位點共定位。

為確定致病或可能致病突變是否在癌症樣本中富集，在含33,370例的外顯子組集合組資料庫中，比較TCGA與非TCGA病例的等位基因頻率，發現30個獨特突變為暗示性關聯。經多重測試閾值，前四個相關突變為ATMp.E1978*、BRCA1p.Q1777fs、POT1p.R363*和PALB2p.R170fs。該結果還為METp.H1112R和MPLp.F126fs等突變致癌提供了佐證。

在TCGA隊列中，也有已在1120例兒科癌症中發現的28種致病或可能致病突變，包括BRIP1、ERCC3、FANCC、MSH2和WRN中的終止密碼子獲得性突變。此外，在多腫瘤完成隊列數據（MC3）庫中觀察到23例胚系突變與複發體細胞突變共定位。獨特突變包括TP53中的8個錯義突變、4個NF1截短突變和2個RET錯義突變。TP53p.R248W是高複發的體細胞突變（n＝94），而在兒童橫紋肌肉瘤和低級別膠質瘤中則為胚系突變。多發性內分泌腫瘤2型相關等位基因RETp.M918T在嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤出現並與MN2B紊亂有關，也屬複發性體細胞突變。總之，在TCGA腫瘤類型中觀察到的複發性體細胞突變及嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤突變與致病或可能致病突變之間高度重疊，意味著兒童和成人癌症、胚系和體細胞基因組的共致癌易感。

翻譯後修飾位點的突變

為研究胚系突變對蛋白信號的潛在功能影響，853個突變映射到316,216個已知翻譯後修飾位點上。共發現錯義突變引起的65個氨基酸替換與34個獨特翻譯後修飾突變直接重疊或相鄰，並在1000個基因組資料庫中觀察到突變體的富集。致病性翻譯後修飾替換相關的前六個基因為VHL（n＝10）、CHEK2（n＝9）、BUB1b（n＝9）、TP53（n＝8）和RET（n＝6）。這與先前的結果一致，即翻譯後修飾位點在普通人群中替換缺失，而在疾病突變情況下富集。

為闡明胚系突變在信號網路系統的假定機制，翻譯後修飾相關替換被全面映射到已知位點的特異性酶-底物互作上。9（/18）個基因中超過60%（21/34）的獨特替換髮生在上游激酶和其它種類酶結合的已知蛋白位點上。TP53中可能影響激酶結合的5個替換位點，如Aurora激酶A（AURKA）和CHIK2（檢查點激酶2），以及MDM2和EP300等其它信號酶，在響應細胞刺激時激活或抑制TP53。五個VHL突變發生在與NEK1激酶結合的位點，促進其降解。同樣，CHIK2p.S428 F可能影響CKK2激酶的自磷酸化和活化。RETp.V804M和p.R921P對自磷酸化位點有潛在作用，需要RET激酶活性。BRCA1p.R169W通過破壞BRCT重複序列而顯著減弱與BAC1肽的結合。這些結果表明，致病胚系癌症易感突變的群體可通過破壞和重連複雜的蛋白信號網路來展示其功能。

討論

本研究證明了腫瘤和正常匹配測序在解釋胚系突變中的效用，能用它們發現雜合性丟失或雙等位基因突變等二次突變。雖然這些方法提供了胚系突變的系統評估，但需要仔細評價複合因素的不同影響，如可能誘導雜合性丟失的撘便車體細胞拷貝數突變等。這些信息也可能有助於證實多效基因突變的致癌效應。那麼，癌症信息不僅有助於確認致病突變，還能確定大量不明意義突變優先順序，發現非編碼基因組。

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由美國芝加哥大學微生物、分子基因生物學系和芝加哥大學醫學院的終身教授，美國科學院、醫學院、發明家學院/中國工程院外籍院士伯納德?羅茲曼（Bernard Roizman Sc.D.）創辦，學院重在培養科研人才，在中國進行轉化醫學研究和生物醫藥的研發，並對研究成果進行產業化。

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伯納德?羅茲曼是美國芝加哥大學微生物、分子基因生物學系和芝加哥大學醫學院的終身教授。他畢生從事於單純皰疹病毒的分子生物學研究，擁有「皰疹病毒之父」之稱。羅茲曼終身致力於對皰疹病毒分子生物結構的全方位解讀，在破譯單個病毒基因功能以及部分基因對病毒潛伏感染和激活的作用，以及病毒改造治療癌症等領域取得重要進展。

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