Nature communications：體內活性氧研究邁出重要一步

本文由George編譯，董小橙、江舜堯編輯。

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導讀

眾所周知，腫瘤細胞相較於非轉化細胞能產生更多的活性氧（ROS）。高濃度水平的ROS能夠導致DNA、脂質和蛋白質的氧化，從而影響到細胞功能，比如氧化DNA導致突變的產生和DNA鏈的斷裂，最終產生癌症。ROS同時也會作為信號介導媒介對蛋白質半胱氨酸殘基進行修飾。

為了全面的了解ROS，對氧化還原反應調控蛋白質綜合定性分析和細胞通路分析非常重要。隨著質譜技術的不斷發展，雖然已有一些分析半胱氨酸硫醇氧化的策略，但是在全蛋白質組範圍內分析修飾的半胱氨酸殘基仍然存在技術挑戰。

本文中，研究人員開發了一種無需富集半胱氨酸肽段的，簡便、無偏差的定量蛋白質組學分析方法SICyLIA（Stable Isotope Cysteine Labelling with IodoAcetamide，穩定同位素碘乙醯胺標記半胱氨酸法），對不同細胞模型和原代組織進行蛋白氧化分析。採用的是延胡索酸水合酶缺陷型小鼠（Fh1-/-）的永生原代腎臟上皮細胞和腎臟組織作為慢性氧化模型樣本, 對照組採用野生型同基因（Fh1fl/fl）小鼠。結果顯示急性和慢性氧化應激氧化代謝相關蛋白質，產生了特定的代謝適應性。分析腎臟蛋白質組顯示慢性胞內氧化應激影響組織重建，氧化循環體液中的蛋白，從而影響整個身體的生理狀態。

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論文ID

原名：Proteome-wide analysis of cysteine oxidation reveals metabolic sensitivity to redox stres

譯名：全蛋白質組半胱氨酸氧化分析揭示了代謝對氧化還原電位敏感

期刊：Nature communications

IF：12.124

發表時間：2018年

通信作者：Liang Zheng

通信作者單位：Cancer Research UK Beatson Institute, Switchback Road, Glasgow G61 1BD, United Kingdom

試驗內容

1、對半胱氨酸氧化的蛋白質組學定量

圖1為SICyLIA技術的流程圖。a圖顯示樣品在有輕的（12C2H4INO）或重的（13C2D2H2INO）碘乙醯胺存在的情況下提取，並對開放的半胱氨酸硫醇進行烷基化，生成半胱氨酸經碘乙醯胺（CAM）。同等量修飾蛋白質提取物進行混合，用DTT對可逆氧化的硫醇進行降解，用N乙基馬來醯亞胺進行烷基化。蛋白質提取物酶解成肽段，採用UHPLC-MS/MS進行分餾分分析。b圖，作為平行試驗，標記的蛋白組提取物採用胰蛋白酶進行消化，並使用輕（H12CHO/NaBH3CN）或重（D13CDO/NaBD3CN）甲醛/氰基硼氫化鈉進行二甲基化，同樣進行UHPLC-MS/MS分析。

圖1 SICyLIA技術的流程圖

SICyLIA工作流程用於區分急性（H2O2處理）和慢性（Fh1缺陷型）氧化應激生物學模型，並評估其性能。分別在小鼠細胞和腎臟組織中檢測到18022條和13112條含半胱氨酸的唯一肽段。

圖2 三個不同的實驗模型所檢測到的蛋白及肽段數目

經過嚴格的質控，最終分別在細胞和組織挑選出3563和2168個蛋白質進行後續分析。結合Perseus軟體Significance B等一系列數學統計方法，在H2O2模型（急性）中鑒定到333個明顯氧化或還原的肽段，而Fh1細胞模型（慢性）中有252個，Fh1組織模型（慢性）中有150個。

2、ROS通過蛋白質氧化誘導代謝適應能力

研究人員對培養基中過氧化氫穩定性進行定量分析，顯示在不含有細胞時，過氧化氫會緩慢分解。而當細胞存在時，很快便被代謝掉了，半衰期在15-30min。因此對Fh1fl/fl細胞，用過氧化氫處理15min。細胞在該條件下受到很大影響，但仍保留短期增殖和長期克隆形成能力。對細胞內代謝化合物進行測定，當受到500μm過氧化氫處理15min後，NAD（P）+/NAD（P）H比率大為增加。綜合看來，過氧化氫處理策略能導致重急性氧化應激，而隨著時間增加，細胞能夠恢復體內平衡。

圖3 過氧化氫處理Fh1

fl/fl細胞導致可恢復的氧化應激

同時，結果顯示在過氧化氫處理後，很多肽段氧化或還原程度增加。而對整體氧化水平進行功能結果分析，判斷其中的半胱氨酸殘基是否具備功能域。UniProt Feature Keys注釋結果顯示，催化活性、金屬離子結合等是特定的相關功能。

圖4 散點圖示意FeatureKey注釋

半胱氨酸殘基在過氧化氫處理後會被修飾，並以蛋白質激活位點居多。具有金屬離子結合功能的位點在用過氧化氫處理時，不容易被氧化。一些特定蛋白，如過氧化物氧化還原酶家族（Prdx1-6），會在半胱氨酸殘基形成二硫鍵的位點被修飾。

GO注釋的結果顯示修飾肽段參與應激、ROS反應（GO生物學過程）；具有抗氧化、過氧化物氧化還原酶和過氧化物酶活性（GO分子功能）；同時，也發現其中有線粒體相關細胞組分（GO細胞組分）。

圖5 GO注釋結果示意圖

有趣的是，基於GOBP分析到的修飾肽段大多源於代謝相關蛋白質。當與其它蛋白質進行比較時，代謝相關的蛋白質半胱氨酸含量不會有變化。而代謝相關蛋白半胱氨酸殘基氧化說明了對於氧化應激，這是一種選擇性反應。

為了驗證氧化修飾導致的功能性結果，研究人員針對數據中氧化率較高的代謝酶——GAPDH做了後續工作。而該酶通過將3-磷酸甘油醛（G3P）轉化為1,3-二磷酸甘油酸來實現對NAD+的催化。過氧化氫處理Fh1fl/fl細胞導致糖酵解途徑上游中間代謝物快速轉化積累至G3P，而下游糖酵解代謝物含量降低，表明了GAPDH的活性有所抑制。

圖6 過氧化氫處理後細胞內糖酵解代謝物的變化

進一步分析磷酸戊糖（PPP）途徑，顯示過氧化氫對GAPDH抑制作用誘導糖酵解流快速轉移至PPP，多次碳循環增加了NADPH產量，抗擊ROS。GAPDH底物G3P的累積和下游代謝物3-磷酸甘油酸酯的消耗，並能在過氧化氫處理15min後能快速恢復基線水平，即GAPDH活性可恢復。

綜合看來，急性氧化應激通過代謝相關蛋白和線粒體相關蛋白的氧化，引起代謝適應性。同時增加了PPP中還原當量的含量，內生ROS含量也通過抑制線粒體呼吸作用而達到最低值。

圖7 過氧化氫處理前後，糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑13C6葡萄糖共培養條件下胞內代謝物中同位素體所佔比重

圖8 GAPDH氧化抑制是瞬時現象，同時急性氧化應激減少線粒體呼吸

慢性氧化還原應激導致代謝相關蛋白質氧化

3、慢性氧化還原應激導致代謝相關蛋白質氧化

研究人員採用SICyLIA分析Fh1-/-細胞（經歷慢性氧化應激）與同基因系對照（Fh1fl/fl）的差異。結合穩定同位素標記的相對定量蛋白質組學技術，FH蛋白必然是最為顯著下調的蛋白質。此外，由於FH缺失細胞三羧酸循環被截斷，ATP生成依賴於糖酵解途徑，因此糖酵解相關酶類過表達（Hk1，Gpi, Pfkl, Tpil, Pgk1, Pgam1, Eno1, Pkm, Ldha, Ldhb）。

與Fhlf1/f1細胞被過氧化氫處理後類似，Fh1-/-細胞共有20848條含半胱氨酸的肽段被檢出。對蛋白丰度進行標準化處理，從獲得的8681條肽段中計算肽段的氧化率。因此，在Fh1-/-細胞中找到252條（2.9%）含半胱氨酸的肽段被顯著修飾。基於UniProt Feature Keys進行功能性注釋，絕大多數顯著修飾的半胱氨酸殘基參與二硫鍵形成。

同時，為了進一步描述細胞對氧化還原應激的適應，研究人員分析了急性氧化應激中，優先被氧化的代謝相關蛋白是否也涉及慢性氧化應激。在基於肽段氧化率的前提下，同時在兩種模型中被顯著富集到的代謝網路是Recon 2。在基於GO分類分析中，細胞氧化還原反應平衡性過程也同時在兩種模型中被顯著富集。令人驚訝的是，在兩個模型中，絕大多數代謝相關蛋白的顯著修飾位點並不相同，僅有4個蛋白在相同的氨基酸殘基上進行了修飾（Aldh18a1, Cox6b1, P4hb, Pla2g4a）。對兩個模型的細胞氧化還原體內平衡過程進行比較，顯示出較高的重疊率。這些結果說明急性和慢性細胞氧化應激能氧化特定的蛋白集合，從而使細胞適應特定的生理條件。

圖9 a圖 Fh1-/-細胞與Fh1fl/fl細胞相比較，蛋白水平比率與蛋白強度的關係；b圖 肽段氧化率與肽段強度的關係；c圖 急性與慢性氧化應激模型兩種富集分析的比較；d圖韋恩圖展示兩種條件下，Recon2代謝網路中重疊的蛋白數目；e圖 氧化還原平衡過程中，兩種條件下重疊的蛋白數量。

4、腎臟組織中的慢性氧化應激反應

為了驗證該方法和工作流程直接應用於器官研究的可行性，研究人員採用FH缺失的Fh1fl/flKsp1.3/Cre基因工程小鼠模型進行研究。由於腎臟中缺失Fh1，因此形成了嚴重的囊腫。

對樣品進行蛋白質組學分析，定量到4415條肽段，還原至2168個蛋白質。其中有150條肽段在半胱氨酸位點發生了顯著修飾。功能注釋分析顯示幾乎所有的顯著修飾半胱氨酸殘基參與了二硫鍵形成，與Fh1細胞模型類似。此外，與Fh1-/-細胞類似，腎臟組織中富集到代謝相關蛋白具有修飾肽段（Recon 2代謝網路）。顯著修飾的肽段來源於組織結構的不同成分，既包括胞內蛋白，也檢測到脈管系統和尿液中的胞外蛋白。血漿白蛋白（Alb）被鑒定到多條肽段存在氧化修飾，而該蛋白通常在不同腎臟疾病病人體內表現為主要的氧化靶標。

比較分析參與細胞氧化還原體內平衡的顯著修飾蛋白質，發現雖然很多蛋白在不止一個模型中被顯著修飾，但其它的蛋白的修飾確存在相互排斥的模式。此外，一些來自於線粒體ETC複合物的組分也被顯著修飾，特別是ComplexI。

圖10 a圖 兩種模型腎臟組織切片圖；b圖 Fh1

-/-小鼠vs Fh1fl/fl小鼠腎臟組織樣品中肽段氧化率vs肽段強度的關係；c圖 急、慢性細胞模型和腎臟模型中鑒定到參與細胞氧化還原平衡過程的顯著修飾蛋白數量；d圖三種模型來自線粒體電子傳遞鏈中被顯著修飾的複合物

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結論

本文作者通過對不同模型樣品進行蛋白質組學分析（SICyLIA workflow），揭示了急性和慢性氧化應激通過直接氧化代謝過程和線粒體相關蛋白質來使機體產生代謝適應性。本文的結論為將來用臨床病人和健康捐贈者組織作為樣本，研究氧化應激相關的人類疾病提供了理論支撐。

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