線粒體乙醯化：蛋白組學，sirtuins去乙醯化酶，以及對代謝和疾病的影響
賴氨酸乙醯化是第一個被定義的組蛋白殘基的修飾。組蛋白乙醯化修飾同時受組蛋白乙醯基轉移酶和去乙醯化酶的調控。在過去的20年中，蛋白乙醯化修飾範圍已經從組蛋白擴展到亞細胞結構及細胞各項生命活動中的蛋白。最近的一項蛋白組學研究確定了蛋白乙醯化修飾的3000多個位點，並且認識到乙醯化修飾是各種醯基化修飾的中心，這些醯基化修飾存在於各種生命中，並且調節細胞的轉錄、代謝等過程。2018年，Chris Carrico等在《Cell Metabolism》上發表了《The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications》綜述，對乙醯化的生物學意義及其對線粒體功能、代謝調節和疾病的病理生理過程做了如下綜述。
線粒體sirtuins：SIRT3、SIRT4和SIRT5是蛋白去乙醯化酶
第一個線粒體去乙醯化酶SIRT3的出現，表明線粒體中也存在乙醯化修飾。SIRT3是NAD+依賴的去乙醯化酶，以乙醯輔酶A合成酶2為靶點。早期的研究發現SIRT3缺失的小鼠線粒體蛋白乙醯化顯著增加，說明SIRT3是主要的線粒體蛋白去乙醯化酶。而SIRT4或SIRT5缺失的小鼠則沒有出現明顯的線粒體蛋白乙醯化的增加，說明SIRT4或SIRT5僅調控一部分蛋白的乙醯化修飾。SIRT4是目前所知最少酶活性的線粒體sirtuins。最近有研究發現SIRT4有微弱的蛋白去乙醯化酶活性，作用於小部分的底物蛋白。（圖1）
圖1. SIRT3~5調控的線粒體乙醯化修飾
SIRT3調控線粒體蛋白乙醯化修飾
2006年首次報導了賴氨酸乙醯化的蛋白組學研究，結果發現細胞質和細胞核中有195種蛋白的388個乙醯化位點，而在195中蛋白中，僅有13種已知蛋白，更加有趣的是，超過一半的乙醯化位點和蛋白定位於線粒體。這項研究表明賴氨酸乙醯化也存在於線粒體中，構成了獨特的線粒體乙醯體調控的網路框架。
研究也發現乙醯化修飾是一個調控蛋白與蛋白相互作用的重要方式。細胞乙醯化修飾影響了細胞功能的方方面面，質譜分析的結果顯示乙醯化的蛋白涉及多條代謝通路，包括脂肪酸代謝、糖酵解途徑、三羧酸循環及尿素循環。動物實驗發現SIRT3缺失的小鼠蛋白呈高度乙醯化狀態。進一步對線粒體蛋白純化的分析結果顯示，136種蛋白乙醯化水平在SIRT3缺失的小鼠中顯著增加。Choudhary等分離野生型及SIRT3缺失小鼠的胚胎成纖維細胞，對蛋白乙醯化位點進行鑒定，發現在眾多的乙醯化位點中，超過100個位點在野生型及缺失型小鼠中的乙醯化存在2倍差距。而SIRT3缺失小鼠中蛋白乙醯化位點的增加大部分存在於線粒體內，這些蛋白與三羧酸循環及脂肪酸代謝呈現出良好的相關性。Coons和Denu等的研究發現熱量限制（calorie restriction，CR）改變了線粒體蛋白的乙醯化水平。他們通過對野生型及SIRT3缺失型小鼠分別分為正常飼養組及熱量限制組，鑒定出3285個乙醯化位點，其中包括434種線粒體蛋白的2193個乙醯化位點。四組不同的處理出現三類乙醯化位點，第一類與SIRT3的表達相關，第二類在能量限制的情況下增加，第三類則在三種處理條件下變化都很微弱。
SIRT5調控酸性醯基修飾、賴氨酸琥珀醯化、丙二醯化及戊二醯化修飾
Hening Lin團隊在試圖解釋SIRT5缺失去乙醯化酶活性時發現了SIRT5的底物結合口袋區域存在一個精氨酸殘基，意味著SIRT5可能結合併以酸性醯基蛋白為靶點。體外實驗發現SIRT5存在NAD依賴的去琥珀醯化酶活性，體內實驗也間接驗證了這一點。另一項研究也證實SIRT5調控賴氨酸琥珀醯化及丙二醯化修飾。來自兩個不同實驗室的研究採用SIRT5缺失小鼠的肝組織和小鼠胚胎成纖維細胞進一步對此進行了驗證，發現779種蛋白的2565個琥珀醯位點。KEGG通路分析發現線粒體支鏈氨基酸（BCAA）代謝和TCA循環是兩條最主要的通路。
Verdin和Gibson等發現丙二醯化蛋白存在於多種組織中；SIRT5缺失時，丙二醯化蛋白在腎臟及肝臟中廣泛存在，尤其存在於細胞質。這項研究與存在於線粒體內SIRT5依賴的琥珀醯化修飾形成了鮮明的對比。對SIRT5野生型及缺失型小鼠肝臟組織進行質譜分析，結果鑒定出430種蛋白的1137個丙二醯化位點，其中183個位點在SIRT5缺失組表達增加。通路分析SIRT5調控的蛋白主要集中在糖原合成和糖酵解途徑通路，其次是尿素循環通路。
逐漸顯現的受SIRT4調控的醯基化修飾
對第三個線粒體sirtuins家族分子SIRT4的研究滯後於SIRT3及SIRT5，但近來的研究也逐漸闡明SIRT4的功能。一項研究發現SIRT4調控丙酮酸脫氫酶的賴氨酸脂醯化及生物素化。之前也有報道SIRT4作為一種核糖基轉移酶，調控胰島素分泌。最近也發現SIRT4調控的醯基修飾位點，如甲基戊二酸、羥甲基、戊二酸。重組SIRT4可以去除這些賴氨酸殘基的修飾，SIRT4過表達也使得這些賴氨酸醯基化修飾水平降低。
線粒體蛋白醯基化修飾是如何發生的
在細胞核中，組蛋白乙醯基轉移酶的活性與多種轉錄激活子相關，如GCN5、PCAF、p300/CBP及MOF。這些分子使組蛋白及與轉錄調控相關的非組蛋白賴氨酸殘基發生乙醯化。組蛋白乙醯化在受這些酶調控的同時，也與乙醯輔酶A以一種非酶依賴的方式相互作用，尤其在pH高的情況下。
研究表明線粒體蛋白乙醯化修飾主要是以非酶依賴的過程為主。這些證據包括，超大數量的乙醯化位點，大部分位點化學計量極低，線粒體基質中pH增加，線粒體基質中各種乙醯輔酶A的局部濃度增加。Wagner和Payne通過體外控制這些變數闡明了線粒體蛋白的非酶依賴的乙醯化修飾。他們指出基礎pH和乙醯輔酶A水平的重要性，並發現在一段時間內變性線粒體蛋白呈現較高的乙醯化水平。
線粒體蛋白醯基化修飾的調控
儘管線粒體醯基化修飾的具體機制仍需進一步的研究，現在已發現多種干預因素可影響這種修飾行為，這也為擬通過醯基化修飾及去醯基化修飾的治療提供了新的機遇。飲食攝入及各種組織自身的代謝需求產生乙醯輔酶A，與線粒體中的分子相互作用使靶蛋白髮生乙醯化，而sirtuins通過NAD+使之朝相反的方向發展。
營養過剩與營養不良均產生異常的代謝狀態，使乙醯輔酶A水平增加。禁食狀態下，乙醯輔酶A用於產生能量，肝臟大量合成糖原及酮體。研究發現SIRT3缺失抑制了脂肪酸氧化；同時發現冷刺激使糖異生降低，禁食狀態下β-羥丁酸產生減少。線粒體蛋白的高度乙醯化降低了機體對禁食的適應性，而禁食狀態下SIRT3表達增加則拮抗了這一效應。相較於禁食而言，能量限制時肝臟及腎臟線粒體乙醯化增加，但腦內乙醯化水平沒有變化，骨骼肌乙醯化卻降低。另一方面，營養過剩則使肝臟中線粒體乙醯化水平減低。
大部分線粒體代謝通路產生高能量的輔酶A硫脂作為關鍵的中間產物。（圖2）丙酮酸來源的乙醯輔酶A是TCA循環的主要來源，琥珀醯輔酶A是此循環中另一個重要的中間產物。此外，各種輔酶A中間產物進入氨基酸及脂肪代謝途徑，如果沒有線粒體非酶依賴的賴氨酸乙醯化，那麼TCA循環中各種醯基輔酶A則是組織中乙醯化修飾的主要來源。
圖2. 線粒體代謝的中間產物，輔酶A
在應激條件下，線粒體sirtuins表達增加，控制著線粒體蛋白的乙醯化水平。禁食及PGC-1α使SIRT3上調，使之更好的控制脂肪酸氧化及酮體代謝產生的高度乙醯化水平。同樣地，DNA損傷時SIRT4表達增加，來調控損傷應激反應。作為線粒體內僅已知的去乙醯化酶，sirtuins需要NAD+的輔助來發揮作用。NAD+在線粒體代謝中主要作為電子傳遞體，是目前老齡化領域研究的一個熱點。
線粒體醯基化——生物學效應
線粒體醯基化常常起到抑制性作用，而在其他細胞成分中，蛋白醯基化則具有抑制或者激活雙重作用。丙酮酸代謝是線粒體氧化代謝的關鍵起始點，丙酮酸脫氫酶複合體（PDC）控制著TCA循環的活性，產物乙醯輔酶A推動TCA循環的進程。PDC受到各種酶的競爭性調控，如丙酮酸脫氫酶激酶（PDKs），通過磷酸化作用使PDC失活，而丙酮酸脫氫酶磷酸酶（PDP）則逆轉了PDKs的抑制作用。乙醯化的PDHA1招募PDK，使PDC發生磷酸化進而失去活性。相反，SIRT3起激活PDC的作用。
禁食時，SIRT3激活長鏈乙醯輔酶A脫氫酶，利用脂質產生乙醯輔酶A。SIRT3缺失小鼠發生β-氧化前體物質和中間產物的堆積，並且產生類似人類脂肪酸氧化失調的癥狀，如寒冷耐受能力及基礎代謝降低。越來越多的證據表明賴氨酸乙醯化和sirtuins在酮體合成代謝中起重要調控作用。研究發現禁食時，SIRT3或SIRT5缺失小鼠酮體生成減少。HMG-CoA合成酶異構體2（HMGCS2）是酮體生成中的限速酶，使乙醯輔酶A合成HMG-CoA，SIRT3和SIRT5通過去乙醯化和去琥珀醯化作用調控HMGCS2的活性。ROS是線粒體代謝的產物，同時也引起氧化應激反應。SIRT3使抗氧化應激的兩種酶MnSOD和IDH2乙醯化，對抗氧化應激反應。
線粒體醯基化——疾病或者健康
腫瘤發生的機制研究甚廣，SIRT3在不同的腫瘤環境中對腫瘤的發生、生長、轉移引起的效應不同。在Warburg效應中，SIRT3使ROS產生減少，在一定程度上抑制了糖酵解過程。SIRT4通過抑制脂肪酸氧化及谷氨醯胺代謝，間接使代謝呈糖依賴性，但SIRT4使代謝減慢，並對糖抑制更加敏感，最終抑制腫瘤生長。研究發現SRIT3有抗凋亡作用，SIRT3的缺失使腫瘤微環境有利於腫瘤的生長。
鑒於線粒體乙醯化在腫瘤發生及ROS產生中的重要作用，那麼線粒體乙醯化同時調控神經功能便不足為奇，研究發現sirtuins的去乙醯化作用能夠改善神經功能。最近有研究發現SIRT3可以抵抗氧化應激對覺醒驅動的伏隔核區的損傷，同時也可減少興奮毒性應激導致的細胞死亡。熱量限制延長了壽命並減緩老齡化進程，而SIRT3在CR對抗老齡化的保護作用中發揮重要作用。營養過剩及其所帶來的肥胖、糖尿病等，主要歸因於乙醯輔酶A前體的過度利用，這一過程驅動線粒體乙醯化發生。目前的研究發現線粒體乙醯化在代謝性疾病中有雙重作用，SIRT3缺失小鼠表型與人類相似，人SIRT3多態性引起的去乙醯化活性降低增加了代謝性疾病發生的風險。
年齡是多種疾病發生的關鍵因素之一，sirtuins對抗老齡化的機體保護作用使其獲得了「抗衰老」蛋白的美譽，儘管sirtuins不能改變所有有機體老齡化的速率，但sirtuins抑制疾病進展並延長了壽命。SIRT3一方面減弱了應激的不利影響，另一方面增強了機體在應激狀態中的生存能力，從而保護機體抵抗氧化應激。而老齡化對sirtuins的功能也產生一定的影響。NDA+呈現年齡依賴性減少，限制了sirtuins的作用；在老齡化中，破壞NAD的酶CD38抑制SIRT3對線粒體高度乙醯化的控制從而導致線粒體功能失調。
論腫道麻的點評：乙醯化將何去何從？
目前的研究為我們提供了一個大規模又複雜的資料庫，涉及大量蛋白的乙醯化修飾。與此同時，日益增多的線粒體蛋白的乙醯化作用影響了各種酶的功能，而我們對乙醯化機制及調控的研究也逐漸加深。目前懸而未決的關鍵問題是多數乙醯化的化學計量問題。除了基於SILAC的化學計量方法，所有的化學計量方法發現所有線粒體蛋白乙醯化位點平均不足1%。這引起了乙醯化作用在生物學領域的激烈爭議。除非乙醯化修飾產生新的作用或者激活新的酶，否則1%的乙醯化水平不足以在體內發揮抑制作用。另一方面，SIRT3、SIRT4、或SIRT5缺失小鼠的代謝表型通路呈現出高度乙醯化水平。未來需要更多的研究來探討並闡釋這一問題。而且，乙醯化修飾範圍的增加進一步擴展了現階段對親核反應如脂肪酸和氨基酸代謝中間產物的認識。這不禁讓我們產生疑問，是否還存在其他目的蛋白也同時發生乙醯化。
綜上所述，賴氨酸殘基的翻譯後修飾-乙醯化，存在於各種通路、功能及機體相關的蛋白中。SIRT3、SIRT4及SIRT5，三個定位於線粒體的去乙醯化酶，以NDA+依賴的方式對其靶蛋白進行去乙醯化修飾。線粒體蛋白乙醯化修飾的蛋白組學研究也發現了SRT3、SIRT5調控的蛋白乙醯化、琥珀醯化、戊二醯化及丙二醯化等其他醯基化修飾作用。線粒體乙醯化修飾受到飲食、乙醯輔酶A的濃度及環境、sirtuins、NAD+等多種因素的調節。醯基化修飾不僅參與了線粒體氧化應激、酮體生成、脂肪酸代謝、糖代謝中各種酶的表達，並且參與了腫瘤、神經系統疾病、代謝綜合征、肥胖、糖尿病等多種疾病的發生髮展過程。未來線粒體醯基體及sirtuins仍需更廣泛更深入的研究，來闡釋其在代謝及疾病發生髮展的作用，為治癒疾病提供新的思路和策略。
（編譯陳祥元；審校繆長虹）
參考文獻：
Chris Carrico, Jesse G. Meyer, Wenjuan He, Brad W. Gibson, Eric Verdin. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metab. 2018 Mar 6;27(3):497-512. doi: 10.1016/j.cmet.2018.01.016.
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