如何將細菌改造成最完美的「腫瘤殺手」？

編者的話·寫在前面

如今，雖然科技的發展日新月異，但癌症依舊是嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，在2011年的cell雜誌上，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg兩位教授將原有的腫瘤細胞六大特徵擴增到了十個：自給自足生長信號、抗生長信號的不敏感、抵抗細胞死亡、潛力無限的複製能力、持續的血管生成、組織浸潤和轉移、避免免疫摧毀、促進腫瘤的炎症、細胞能量異常、基因組不穩定和突變(Hanahan & Weinberg, 2011)。近年來，在實體瘤切除術、化學藥物療法、分子靶向藥物等傳統療法的基礎上，更多新型的腫瘤療法的開發為臨床醫學注入了新的活力，如CAR-T技術、PD-1免疫療法等。另外，基於合成生物學技術的細菌工程化改造又為癌症治療提供了全新的思路，細菌療法由於其更好的靶向性、更低的毒副作用、更廣闊的發展空間、更多樣的治療手段逐漸得到科學重視。由此，本文將為大家介紹細菌療法的最新進展，總結細菌工程化改造的思路方法，分析如何才能夠將細菌改造成為最完美的「腫瘤殺手」。

作者：董宇軒

簡介：中國科學院大學、深圳先進技術研究院在讀碩士，主攻合成生物學改造細菌用於腫瘤治療方向。本科畢業於大連理工大學環境生態工程專業。本科研究方向： 微生物與金屬元素的相互作用以及微生物合成納米材料的特性表徵。

編輯：孟凡康

全文約4500字，閱讀時間約為12分鐘

Introduction

早在200多年前，醫生們就注意到了細菌感染有時會減緩腫瘤生長甚至將其根除。利用細菌治療癌症的方法的提出發生在19世紀中葉，Busch, Fehleisen, Coley等人分別有目的性地讓患者感染化膿性鏈球菌，雖然早期取得了不錯的療效，但顯然患者隨後均死於細菌感染。為降低風險，骨外科醫生Coley將細菌滅活，製成了「Coley Toxin」，其最終成功治療了超過1000名患者。更為驚奇的是，1999年的一項對「Coley Toxin」治療法的分析再次表明，這種治療方法的成功率居然與現代的癌症治療方法不相上下(Richardson &Ramirez, 1999)。隨後越來越多的細菌被報道可以用來治療癌症，包括破傷風梭菌、丁酸梭菌等致病菌以及嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌等非致病菌。在揭示了腫瘤內部的缺氧微環境後，沙門氏菌、李斯特菌、梭狀芽孢桿菌等兼性或專性厭氧菌被認為是較為理想的腫瘤治療的選擇。沙門氏菌由於其兼性厭氧、靶向能力強、具有天然毒性、易於改造等特點，被認為是最理想的腫瘤治療體(Forbes,2010)。

但是，如果僅使用天然細菌作為腫瘤治療，會增加更多的臨床風險，由此，合成生物學作為一門新興的綜合性交叉學科，為腫瘤治療的細菌工程化改造提供了最具潛力的方案。對於細菌工程化改造的中心問題，應該著重於降低細菌毒性、提高靶向能力和多樣化的功能性改造、毒性降低可增加最大耐受劑量;改善靶向能力可增加腫瘤定植;多樣化的功能性改造可以賦予細菌更多的腫瘤治療的能力。機器正在生物化，生物正在工程化，利用合成生物學將細菌重編程為微小的「機器工廠」（fig.1），將為腫瘤治療提供一個理想模型，這個「機器工廠」能夠感受外部壓力、響應內在環境信號、具有自推進能力和靶向腫瘤的特異性，具備選擇性毒性以及易於臨床檢測(Forbes,2010)。

Fig.1：完美的細菌機器工廠模型

Results

1. 靶向腫瘤的特異性

腫瘤異質性是惡性腫瘤具備的特徵之一，這種異質性的存在使腫瘤的生長速率、侵襲能力、耐藥性等方面都有相應影響，這也被成為腫瘤治療的「攔路虎」。但幸運的是，異質性導致了腫瘤內部的缺氧環境，這為細菌治療提供了先決條件，兼性厭氧菌或專性厭氧菌可以在腫瘤組織內大量增殖，與腫瘤細胞競爭營養物質，抑制腫瘤生長。與傳統的化療藥物相比，細菌藥劑的體內輸入是一個主動的運輸過程，細菌可以依靠鞭毛遊動性自我推進，自主尋找適合自身生長的環境，傳統的藥物遞送是依靠血液的流動性被動給葯，這就導致了藥物不能更好的深入腫瘤組織內部，降低了腫瘤治療效果。腫瘤表面複雜的血管系統和結構促使腫瘤能夠抵抗外部因子的侵襲和滲入，但細菌的滲透性是依賴於其能夠識別腫瘤表面的天冬氨酸、絲氨酸等的小分子梯度(Kasinskas & Forbes, 2007)，宿主的免疫系統和其他組織的氧氣濃度又能夠避免細菌的逃逸。

另外，兼性厭氧菌靶向腫瘤的機制更為複雜，包括在腫瘤混沌的脈管系統中的細菌包埋、隨炎症反應浸潤到腫瘤中、在腫瘤特異性微環境中優先生長等等(Forbes, 2003)，這給臨床治療增加了很大的潛在風險。所以，對於兼性厭氧菌的合成生物學改造成為必然，香港大學黃建東教授研究團隊通過基因工程重組技術和合成生物學的理念成功將沙門氏菌改造為專性厭氧菌YB1(Yuet al., 2012)。為避免細菌天然毒性對於宿主機體過度的危害性，對於細菌的減毒處理是必要的，沙門氏菌可以通過缺失參與代謝的物質來降低毒性，同時又保存了細菌原有的侵襲能力和對腫瘤組織的專一趨向性(Freemanet al., 2001)。

2. 細菌治療的功能性改造

2.1 癌症的早期篩查檢測

由於大部分癌症在早期癥狀不明顯、潛伏期較長，從而導致患者極易錯過治療的黃金時期，更令人「談癌色變」的是，很多癌細胞發展的速度之快令人咋舌，很有可能幾個月內就會擴散、轉移，並很快發展為晚期，所以研發癌細胞的檢測工具作為早期癌症的篩查系統尤為重要。現代醫療通常將腫瘤標誌物用於臨床的早期篩查診斷和預後療效預測(Deyati,Younesi, Hofmann-Apitius, & Novac, 2013)，但腫瘤標誌物在癌症早期的檢測的效果難以滿足要求，開發新的篩查方法成為腫瘤治療的一個新的方向。UCSD和MIT的研究團隊將大腸桿菌改造成特殊的生物感測器（fig.2a），從而就能夠檢測肝臟中的腫瘤，隨後還能夠對尿液進行檢測，通過簡單的顏色變化來判斷患者的腫瘤進展情況(Bhatia,2015)。基於癌症初期血液中鈣含量升高的特徵，來自瑞士巴塞爾大學的Martin Fussenegger教授和他的團隊開發了一種基於合成生物學的生物醫學紋身（fig.2b），當這些工程化的細胞植入到皮下後，就能通過分泌誘發細胞變黑的黑色素來對血液中鈣質水平的增加產生反應，檢測癌症引起的高鈣血症(Fussenegger,2018)。

Fig.2a：PROP-Z診斷平台工作模式圖

Fig.2b：生物醫學紋身原理圖

2.2 細菌免疫療法

由於腫瘤細胞的免疫逃逸機制，導致宿主免疫系統無法識別並正常殺傷腫瘤細胞，另外腫瘤細胞招募或誘導免疫抑制細胞阻礙抗腫瘤免疫活性的誘導和發展，將免疫系統作為其自身生長的「幫凶」，所以如何喚醒免疫系統和重新尋找腫瘤細胞作用靶點成為了生物醫藥界的難題。2012年，Karbach J等報道了「Coley Toxin」的作用機制其實是重新喚醒了的宿主的免疫系統對腫瘤細胞有抑制作用(Karbach etal., 2012)，新加坡南洋理工大學的研究員Teoh Swee Hin更新了Coley的研究工作，Teoh和他的同事們，通過使用滅活的梭狀芽孢桿菌證明了對腫瘤的抑制作用(Bhaveet al., 2015)。

已有報道表明，細菌的分泌物不僅能夠間接激活免疫系統，也能夠直接作用腫瘤細胞，雖然細菌免疫療法的機制尚未完全理解，但是迄今為止的研究發現表明細菌療法在腫瘤微環境中具有強烈的免疫調節作用，所以對於細菌免疫療法而言，需要解決的關鍵問題是如何改造細菌作為向宿主遞送免疫原性腫瘤抗原的載體。腫瘤微環境中，促腫瘤的炎性細胞包括腫瘤相關巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞、髓源性抑制細胞和調節T細胞等等，採用細菌免疫療法就是通過將細菌作為藥物載體、遞送細胞因子干預腫瘤相關免疫細胞的作用，總結歸納如圖Fig.2c(Kaimalaet al., 2018)。對於細菌免疫療法的開發及增強激活能力，Min等成功地將減毒的沙門氏菌基因工程化改造分泌創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB，刺激TLR5和TLR4信號通路協同活化，提高腫瘤抑制因子的分泌，增強腫瘤抑制效果(Zheng, 2017)。（另外，基於RNA的免疫調控基因電路的癌症免疫療法相關內容可閱讀羅訓訓同學的Regenesis文章，傳送門：癌症免疫療法：基於RNA的免疫調控基因電路）

Fig.2c：細菌免疫治療對宿主中不同腫瘤相關免疫細胞類型的多種作用

2.3 藥劑載體的靶向運輸

理想的細菌藥劑載體應該具備選擇性遞送能力和釋放藥物的可控性，既要保證藥劑釋放在特異性靶點位置又要保證釋放藥物劑量的可操控，對於選擇性遞送，厭氧細菌的作用明顯，通過細菌靶向病灶釋放細胞毒素或細胞因子抑制腫瘤生長，比較常用的細胞毒素包括抗腫瘤壞死因子TNFα和TNF相關的誘導凋亡配體TRAIL等，針對藥劑釋放激發宿主免疫系統應答詳見2.2，這裡不再過多贅述。對於胰腺癌替代療法的開發，Wilber Quispe-Tintaya等將放射性同位素與李斯特菌偶聯，增強了對腫瘤細胞的殺傷能力(Quispe-Tintayaet al., 2013)。UCSD的Jeff Hasty教授的科研團隊基於群體感應基因迴路，構建了細菌同步周期性的藥物合成和裂解釋放系統，最大程度上維持體內較低的細菌定殖數量、減少對周圍組織的損傷以及毒副作用(Din et al.,2016)。

Fig.2d：細菌同步周期性裂解迴路的構建及表徵

Future Perspective

改造細菌的腫瘤療法需要嚴格考察生物安全問題，在將細菌改造為「腫瘤殺手」的同時，如何確保改造細菌不會逃逸到自然生態系統中，建立生物安全的防控系統是必要的。比較成功的研究方法包括自殺開關、遺傳防火牆和營養缺陷型的細菌改造，重編碼生物體的合成能夠有效避免工程微生物和天然微生物的相互作用。儘管進一步的研究和開發對於實現這些技術的全部潛力是必要的，但迄今取得的進展讓我們感到樂觀，即重新編碼的生物體有朝一日將有助於臨床使用的工程菌的安全。

未來的癌症治療技術，不能僅僅依靠合成生物學構建的最完美的「腫瘤殺手」改造菌，還需要與傳統的癌症治療技術以及免疫療法結合利用，這樣可以更大程度上地滿足治療需求，同時，另一個發展方向是關於癌症的個性化醫療體系的建立，個性化醫療旨在針對不同患者的基因組信息、免疫系統差異，尋求最優化的治療方案，達到最高效的治療效果和最低的毒副作用，未來對於細菌不同功能性的改造，可以組建「腫瘤治療細菌庫」，標準化、工業化、體系化的腫瘤醫療任重道遠。

（參考文獻在文末）

附作者研究導師及研究所簡介

劉陳立 研究員

博士生導師，「青年千人」、中科院「百人計劃」，廣東省傑青。合成生物學研究所所長、定量合成生物學研究中心主任，主要研究方向是利用合成生物學基因線路探索生物學的基本原理、以及用於腫瘤治療和定向進化方法開發。

深圳先進技術研究院合成生物學研究所（SIAT-iSynBio）

iSynBio成立於2017年12月，前身是中科院深圳先進技術研究院醫藥所合成生物學工程研究中心（CSynBER）。合成所採用合成生物學的工程化設計理念，專註於人造生命元件、基因線路、生物器件、多細胞體系等的合成再造研究，旨在揭示生命本質和探索生命活動基本規律。研究所積極開展面向市場的、以產業化為導向的技術轉化，力求發展成為國際上具影響力的合成生物學研發基地與產業創新中心。研究所通過打造開放交叉合作的平台，匯聚國內外合成生物學領域青年骨幹及海內外領軍科學家，目前所內已有11個PI實驗室和4個企業聯合實驗室，已匯聚形成了一個年輕有活力、多學科合作交叉的前沿創新群體。研究所下設3大中心:定量合成生物學研究中心、合成生物化學研究中心、合成基因組學研究中心。

References

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